背景：
基因疗法将彻底改变现代医学，在治疗和治愈遗传疾病方面似乎有无限的潜力。对于其他无法治愈的适应证(包括大多数遗传代谢性肝病)，基因治疗提供了一个现实的治疗选择。
简介：
2023年1月16日，来自西班牙纳瓦拉大学CIMA的Gloria Gonzalez-Aseguinolaza教授课题组在Nat Rev Gastroenterol Hepatol（IF: 73.0）杂志上发表题为“Gene therapy for liver diseases - progress and challenges”的文章[1]。在这篇综述中，作者讨论了使用重组腺相关病毒(rAAV)载体治疗遗传性肝病的基因补充和基因编辑，包括正在进行的几项临床试验的最新情况，这些试验正在产生有前景的结果。临床试验对于凸显与这种转化疗法相关的许多关键转化挑战至关重要。特别是，患者免疫系统与载体的相互作用提出了安全性和疗效持续时间的问题。此外，大剂量rAAVs给药后发生的数起严重不良事件提示，固有免疫应答和预先存在的肝脏疾病的参与程度超过最初预期。最后，与rAAV基因组整合和基因编辑相关的宿主基因组永久性修饰引起了对致癌性风险的担忧，需要仔细评估。本文总结了肝脏疾病基因治疗的主要进展、面临的挑战和未来的路径。
主要结果：
rAAV载体的基础。
野生型腺相关病毒(Wild-type adeno-associated viruses, AAVs)是由直径20 ~ 25 nm的二十面体蛋白衣壳和两侧有两个反向末端重复序列(inverse terminal repeats, ITRs)的单链DNA基因组组成的小型非致病性病毒。aav可感染多种脊椎动物，包括人类和非人灵长类动物。AAVs天生缺乏复制，依赖与辅助病毒的合并感染来复制，这一特点非常有利于其作为递送载体。由于AAVs的这些特性以及与其他病毒载体相比相对较低的免疫原性，重组AAVs (rAAVs)已成为最常用的基因传递载体。
rAAVs与野生型AAVs共享相同的衣壳序列和DNA结构(包括ITRs)，但所有编码序列均已被转基因表达盒取代。通过质粒转染哺乳动物细胞系(HEK293或HeLa细胞)或重组杆状病毒感染昆虫细胞产生。这种转染或感染将必需的AAV基因(rep和cap)和病毒产生所需的辅助病毒基因，以及携带有ITRs侧翼的治疗性表达盒的重组基因组结构引入细胞。该重组基因组在细胞内的病毒衣壳内组装，从而产生最终的rAAV。
肝脏作为基因治疗靶点。
将rAAV载体用于肝脏靶向基因治疗的重要原因是肝脏的耐受性，肝移植后约20%的患者可撤除免疫抑制，这一事实证明了肝脏的耐受性。几种嗜肝病原体，包括乙型和丙型肝炎病毒、疟原虫、腺病毒和几种非致病性病毒(如AAVs)可利用肝脏免疫耐受。肝脏的免疫耐受特性阻止了对AAV递送的转基因产生免疫应答，从而促进了转基因的长期表达。此外，使用限制转基因在这些细胞表达的肝细胞特异性启动子和调节元件可诱导对重组蛋白产物的耐受。
图1：开发重组AAV基因递送载体的过程
肝脏靶向基因疗法。
在临床前研究中，rAAV介导的肝脏基因扩增已对多种适应证有效，包括血友病、糖原累积病和各种代谢性疾病。特别是在遗传性血友病的治疗方面获得了最广泛的经验。这些遗传疾病不涉及肝脏病理，但肝脏由于不能产生和分泌凝血所需的凝血因子而成为疾病的根源。下文将更详细地讨论该方法的全部影响以及从临床前和临床研究中吸取的教训，但1 ~ 2期临床试验已证明转基因长期表达，且安全性良好。2022年11月，在成功完成3期临床试验后，FDA批准了一种用于治疗血友病B的rAAV产品etranacogene dezaparvovec的生物制品许可申请。血友病B的另一种治疗方法(fidanacogene elaparvovec)和血友病A的两种治疗方法(giroctocogene fitelparvovec和valoctocogene roxaparvovec)目前正在进行3期临床试验。
肝脏靶向基因疗法的局限性。
尽管基于rAAV的基因治疗在临床试验中取得了很有前景的结果，但仍存在一些相当大的局限性。具体而言，衣壳、载体基因组中包含的外源DNA元件和转基因的蛋白质产物可触发宿主免疫应答，从而阻止转基因的有效递送和长期表达。免疫系统激活也可降低基因治疗产品的疗效或引起不良事件。还有许多其他值得密切关注的关注领域，包括肝毒性、补体激活、神经毒性、遗传毒性和效应丧失。
图2：重组AAV介导的基因疗法的免疫障碍和当前的缓解策略
临床前模型的转化有限。
将成功的肝转导和长期转基因表达从小动物模型转化到更大的动物(如非人灵长类动物)和患者，已成为rAAV介导的基因疗法发展的主要挑战之一。例如，在血友病B基因疗法试验的患者中观察到CD8+ T细胞活化导致重组蛋白表达丧失，而临床前动物模型的工作未能预测这一情况，这为我们提供了关于临床前模型缺陷的宝贵经验。
同样，剂量转换也不简单。例如，2×1011 ~ 5×1012 vg/kg剂量的rAAV5或rAAV8全身给药对AIP、Crigler-Najjar综合征和OTC缺乏症的小鼠模型具有治疗效果2，但在非人灵长类动物中，这两种血清型的相同剂量范围导致了在相似研究终点的较低肝转导和转基因表达。此外，在AIP患者中，与在小鼠中提供完全治疗效果的剂量相比，使用更高的剂量并没有改善疾病的生化生物标志物。与小鼠相比，非人灵长类动物中每个细胞的病毒基因组拷贝水平较低，其原因是肝转导效率较低、病毒基因组随时间推移而丢失，还是两者兼有，目前尚不清楚。在一项对非人灵长类动物施用1×1013 vg/kg剂量表达OTC的rAAV8载体的研究中，在第28日至第140日期间观察到转导的肝细胞丧失，这提示转基因表达丧失导致疗效缺乏。然而，这一结果可能是血清型依赖的，因为在非人灵长类动物中，以2×1013 vg/kg的剂量表达OTC的血清型LK03 rAAV可导致持续180天的肝转导和转基因表达。
图3：使用AAV载体进行肝脏基因组编辑的策略
基因毒性。
野生型AAV的整合和致癌性。AAV基因组可以整合到人类基因组的证据首次来自于1980年对AAV潜伏感染的人类细胞的研究。20世纪90年代的研究表明，野生型AAV2可以整合在人类基因组染色体19q13.3-qter区域的特定位点;该位点被称为AAV整合位点1 (AAVS1)，也被称为AAV安全港位点。AAVS1包含的序列与启动复制的Rep68和Rep78蛋白ITRs中的识别位点非常相似，这些序列使Rep能够结合并随后整合AAV基因组。高级测序和整合位点分析表明，野生型AAV2基因组整合到AAVS1位点和其他包含相似Rep结合位点的基因组区域。大多数整合事件只导致AAV基因组的部分整合。对整合机制的深入了解已被用于在AAVS1基因座设计Rep指导的靶向整合策略。
插入突变。在rAAV疗法的开发过程中，对插入致癌的担忧是最重要的。最初的体外研究表明，rAAV基因组的整合是随机的，并通过非同源重组发生，优先发生在染色体断裂位点。整合的部分rAAV基因组已被鉴定，但整合的转基因基因的表达因组蛋白修饰和染色质浓缩而被沉默。这些发现支持之前的观点，即rAAV基因组的附加拷贝是体内长期表达的原因。
rAAV介导的基因组编辑器表达的风险。修饰宿主DNA的疗法带来了几个安全性问题，并且当rAAV用于递送基因编辑机制时，理论上的风险更大。脱靶DNA编辑是一个被广泛关注的问题，携带基因编辑器的rAAV基因组的附加稳定可能会随着时间的推移增加脱靶修饰的可能性。已经开发了几种分析方法来确定这种脱靶效应。必须对人类基因组进行脱靶分析，并对每个目标序列逐个进行脱靶分析;因此，脱靶效应的临床前预测必须通过人类细胞、非人灵长类动物(有局限性)或人源化肝脏模型的体外研究进行。
减轻遗传毒性的策略。为了阐明rAAV基因疗法的潜在遗传毒性，在适当的模型中确定疗法的临床前特征至关重要。此外，能够对rAAV基因组整合进行无偏倚分析的方法将改善风险-获益比的估计值。减少rAAV基因组致癌整合的一种方法是使用不包含启动子的载体，并将其靶向整合到安全基因组区域。理论上，这种方法从两个方面降低了致癌风险:首先，由于靶向性，随机整合事件的频率应该降低;其次，缺乏启动子使整合在内源性启动子下游靶位点的转基因能够表达，但降低了在癌基因附近发生非预期整合时基因表达和诱导失控增殖的可能性。
另一种策略是减少或消除载体基因组中的启动子序列，因为这些是为增加表达的转录因子提供结合位点的开放DNA序列。一般来说，如果包括启动子，使用哺乳动物启动子序列比使用病毒启动子更好，因为它们的活性在人类基因组的环境中可以更好地理解和控制。此外，细胞特异性元件可用于限制转基因在靶组织中的表达。
图4：野生型和重组AAV在临床前模型和人体中的肝脏致癌性研究结果
结论和展望：
自1990年首次基因治疗临床试验以来，该疗法经历了漫长而复杂的历程，跌宕起伏。迄今为止，在许多不同疾病的动物模型中已经证明了治疗的有效性和安全性，但相对较少在临床中取得成功。由rAAV载体介导的基因疗法已成为真正的治疗选择—4种此类疗法(包括1种靶向肝脏的疗法)已获得FDA或EMA批准，3种正在进行预注册，还有更多疗法接近监管评估。
由于AAV的自然嗜肝性，rAAV介导的基因治疗对于遗传性肝病和肝脏蛋白表达有益的疾病的治疗尤其有吸引力。rAAV介导的基因疗法治疗血友病A和血友病B的3期临床试验获得的长期治疗数据，以及治疗OTC缺乏症、GSD1a和Crigler-Najjar综合征的1 ~ 2期试验获得的令人鼓舞的结果提示，多种肝脏靶向基因治疗产品将在不久的将来获得市场批准，为用于治疗其他不可治愈疾病的基因治疗铺平道路。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41575-022-00729-0
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