导读
决明子（CS）在亚洲地区被当作炒茶或药膳食用。它的两种商业形式，即生和炒CS，具有不同的临床应用。其中，炒CS被普遍用作减肥功能性茶。为了防止混淆使用两种形式的CS，本研究提出了一种整合植物代谢组学和谱效关系分析的策略，对生CS和炒CS进行快速、高效的鉴别，并进一步探索CS潜在的降血糖代谢产物以控制其质量。首先，本研究通过UHPLC-QTOF-MS/MS对原、加工样品进行植物代谢谱分析。通过MPP软件分析，我们共发现了1111种差异代谢物，它们能较好地区分生CS和炒CS。随后，我们研究了生的和炒的CS对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。结果表明，炒CS显示出对α-葡萄糖苷酶更强的抑制活性。通过基于GRA、BCA和PLSR的谱效分析，我们发现了14种潜在的降糖化合物。正如预期的那样，它们也被发现是生和炒CS的差异代谢物，具有潜在的降血糖作用，这可能有助于CS的质量控制。此外，我们进行了分子对接分析，揭示了其中4种关键成分的抑制机制，分别是大黄素甲醚（physcion）、黄决明素（chrysoobtusin）、橙黄决明素（aurantio-obtusin）和决明子素（obtusifolin）。本研究为炮制样品的鉴别和复杂天然产物中活性成分的高通量快速筛选提供了有力的工具。
论文ID
原名：Discovery of potential hypoglycemic metabolites in Cassiae Semen by coupling UHPLC-QTOF-MS/MS combined plant metabolomics and spectrum-effect relationship analyses
译名：UHPLC-QTOF-MS/MS联合植物代谢组学和谱效关系分析发现决明子中潜在的降血糖代谢物
期刊：Food & Function
IF：6.317
发表时间：2022.09
通讯作者：楚楚
通讯作者单位：浙江工业大学药学院
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实验结果
1. 生CS和炒CS的代谢组学分析
1.1 广泛的非靶向植物代谢谱分析结果
本研究设计流程图见图1。本研究采用广泛的非靶向代谢组学技术检测了所有样本的植物代谢信息，并对每个样本进行了全局分析。我们对从UHPLC-QTOF-MS/MS所获得的数据进行了定性分析，具体过程为：将所有数据导入MPP软件进行显著性分析，然后剔除不满足条件为“至少在30个样本中出现”的化合物，共得到了差异化合物11056个。我们将所有被检测的样本分为两组，然后采用t检验对数据进行分析。基于计算得到的P值和FC值，1111个特征（P < 0.05和FC > 2.0）被暂时定义为数据集A，它们是生CS和炒 CS的鉴别特征，等待被进一步分析。
1.2 PCA
PCA在据分析中是一种著名的无监督模式识别方法，也是对多维数据进行降维的主要方法。为了充分了解生CS和炒CS之间的聚集和分散差异及其视觉特征，我们对在两组间存在显著差异的1111个化合物进行了PCA分析。如图2所示，黄点和红点分别代表生的和炒的CS样品，不同样品之间存在代谢差异和相似性。PCA的三维得分散点图如图2A所示，PC1（x轴）、PC2（y轴）和PC3（z轴）占总方差的70.69%。同时，所有生CS样本（黄色点）相对集中，表明组内差异较小。而炒CS样品（红点）的空化程度更高，说明组内差异较大，这可能与产地、采集时间以及制备工艺的差异有关。总的来说，生CS和炒CS样本组之间的差异较大，可以很好地被区分。此外，图2B给出了PCA得分散点图，从图中可以直观而明显地看出，CS生样品集中在一组，并与炒CS样品分离，说明CS生样品与炒CS样品之间存在显著差异。图2C显示了一个结合了协方差和相关变量载荷分布的散点图，越靠近“S”的两端，这两组样本的差异越大。因此，在“S”角落里的化合物是有助于两组样品之间区分的差异化合物。图2D显示了1111个差异化合物在两组样品中的分布，结果表明这些差异化合物有助于区分生CS和炒CS样品。
1.3 PLS-DA
作为一种有监督得化学计量学方法，PLS-DA侧重于发现区分组的变量，是一种用于区分和识别潜在生物标志物的可靠工具。有监督的PLS-DA模型能够有效分离差异小的样本，选择出可区分组间特征的变量，并确定两个样本组之间的关系。本研究PLS-DA结果（如图3所示）显示，PC1、PC2、PC3的比例分别为53.87%、11.52%、3.28%。在PLS-DA模型中，两组之间有明显的分离。同时，所建立的PLS-DA模型的精度达到0.925，表明该模型具有良好的拟合和预测能力。
1.4 HCA
HCA是一种统计方法，可根据特征找到相对均匀的群体。如图4所示，我们对生CS和炒CS样品中1111种不同的化合物进行了分析。树状图的颜色表示光谱的归一化峰值强度，其中红色表示高强度，蓝色表示低强度。
图1 基于植物代谢组学和谱效关系发现潜在降血糖代谢物的策略流程图
图2 30份生和炒决明子样品的主成分分析
A: PCA的3D得分散点图；B: PCA的2D评分散点图；C: PCA的C-C Plot图；D：主成分分析的载荷图。在A、B图中，黄色圆点为生决明子样品，红色圆点为炸决明子样品；C和D图中的每个点代表两组决明子中一个差异代谢物。
图3 30份生、炒决明子样品的PLS-DA分析
黄色圆点代表生决明子样品;红点表示炸决明子样本。
图4 30份生炒决明子样品的HCA分析
S1- S15、C1-C15分别代表生样品和炒样品；从蓝色变为红色的色块表示代谢产物的含量增加。
2. 生CS和炒CS的谱效关系分析
2.1 CS样品的UHPLC指纹图谱
图5显示了所有生和炒CS样品的UHPLC指纹。如图5A，我们从15批生CS样品的光谱中选择出了27个色谱峰，编号为P1 ~ P27。如图5B所示，炒CS样本中的24个色谱峰被选择为“特征峰”，其编号为P1~ P24，以进一步探索指纹图谱-低血糖效应关系。
图5 不同批次决明子提取物的UHPLC指纹图谱
A：生决明子；B：炒决明子
2.2 体外降糖活性
α-葡萄糖苷酶抑制作用的IC50值显示在表1中。结果表明，生CS和炒CS都具有明显的降糖作用（图S1）。此外，所有炒CS对α-葡萄糖苷酶的抑制作用都强于生CS，这可能是由于在高温条件下，CS中所含的相应苷类物质在制备过程中转化为对α-葡萄糖苷酶具有抑制活性的游离蒽醌所致。
表1 30批生炒决明子抗糖尿病活性研究
2.3 化学计量学分析
我们采用了GRA法来研究α-葡萄糖苷酶抑制作用IC50值与共有峰面积之间的谱效关系。由表2可知，生CS中除9号峰外，其余26个共有峰的相关度均大于0.6，说明其余26个共峰可能与α-葡萄糖苷酶抑制活性相关。在炒CS中，除3号峰外，其他共有组分的相关性均大于0.6，提示其他23个共有峰可能与抗糖尿病活性有关。
表2 生、炒决明子GRA的相关性及分级
我们采用BCA法建立了共有峰面积与生物活性IC50之间的谱效关系。表3和图6A显示，在生CS中，α-葡萄糖苷酶抑制活性与P2、P3、P4、P5、P6、P7、P10、P11、P12、P13、P14、P15、P17、P18、P20、P21、P22、P23、P24、P26、P27相关（P<0.05）。其中，P3、P4、P7、P10、P13、P15、P17、P21、P22、P23、P24、P26、P27与α-葡萄糖苷酶抑制活性呈正相关。由表3和图6B可知，在炒CS中，α-葡萄糖苷酶抑制活性与P1、P2、P4、P5、P6、P7、P8、P9、P10、P11、P12、P13、P14、P15、P16、P17、P18、P19、P20、P21、P22、P23、P24相关（P<0.05），其中，P2、P4、P5、P6、P7、P10、P11、P13、P18、P19、P20、P21、P23、P24与α-葡萄糖苷酶抑制活性呈正相关。结果表明，这些正相关峰的峰面积越大，样品对α-葡萄糖苷酶的抑制活性越强。同样，随着这些与抑制活性呈负相关的化合物含量的增加，样品对α-葡萄糖苷酶的抑制作用也会减弱。
表3 生、炒决明子BCA的相关性研究
图6 决明子特征共有峰和对α-葡萄糖苷酶抑制活性的BCA模型相关系数
A：生决明子；B：炒决明子
我们采用PLSR法建立了生和炒CS对α-葡萄糖苷酶抑制作用的谱效关系模型。在这项研究中，我们找出了导致低血糖活性的主峰。VIP值是总结变量在解释X和与Y相关方面的重要性的值。VIP值见图7。在生CS中，如图7A所示，对α-葡萄糖苷酶的抑制有贡献作用的峰值顺序为：P27＞P26＞P14＞P6＞P3＞P24＞P11＞P21＞P18＞P23＞P17＞P13＞P10＞P15＞P4＞P22＞P7。其中，对α-葡萄糖苷酶抑制贡献较大且呈正相关的特征峰为：P27＞P26>P3>P24>P21>P23>P17>P13>P10>P15>P4>P22>P7。图7B显示了炒CS对α-葡萄糖苷酶抑制的VIP贡献顺序：P24>P23>P17>P22>P21>P18>P20>P12>P13>P10>P7>P8>P11>P6>P4>P19>P15>P5>P2。对α-葡糖苷酶抑制贡献较大且与之呈正相关的特征峰为P24>P23>P21>P18>P20>P13>P10>P7>P11>P6>P1>P4>P19>P5>P2。
图7 各特征峰对决明子PLSR降糖活性的VIP贡献。A：生决明子；B：炒决明子
3. 功效相关化合物的鉴定
我们采用化学计量法GRA、BCA和PLSR评估了UHPLC指纹图谱与α-葡萄糖苷酶抑制之间的谱效关系。CS中与α-葡萄糖苷酶抑制活性高度相关的正相关峰被认为是与活性密切相关的潜在变量。我们在生CS和炒CS中分别筛选出13个和14个具有潜在的降血糖活性的峰。通过分析Q-TOF MS/MS数据，并将分子离子峰和离子片段信息与参考文献进行比较，我们对这些峰进行了鉴定。详细信息如表S2和表S3所示。图S2为负模态下14个峰的质谱图。它们的化学结构如图8所示。前5位具有较大潜在降糖活性贡献的化合物分别是大黄素（emodin）、大黄素甲醚（physcion）、黄决明素（chrysoobtusin）、橙黄决明素（aurantio-obtusin）和决明子素（obtusifolin），这与文献报道的结果一致。
图8 决明子13种潜在降糖活性化合物的结构
4. 分子对接
我们采用分子对接来确定14种潜在降糖活性化合物的优选结合位点和结合模式，但没有明确结构的桂皮内酯龙胆甾苷除外。由表4可知，所有13种化合物与α-葡萄糖苷酶均具有较好的结合能。图9显示了筛选出的抑制剂与α-葡萄糖苷酶之间相互作用的对接结果。我们采用Pymol 2.3观察了前4个化合物与蛋白质活性袋的结合状态，所有4个化合物都很好地进入α-葡萄糖酶的活性腔。
表4 潜在生物活性化合物的结合能
橙黄决明素的分子对接模型如图9A所示，α-葡萄糖苷酶活性位点上的ASP640、PHE571、ASP305残基与配体C2、C8、C15三个羟基之间存在氢键作用，而PHE307、VAL576、TRP525残基则与配体的甲基间存在疏水相互作用。橙黄决明素与α-葡萄糖苷酶的结合能较低（-8.2 kcal/mol）。α-葡萄糖苷酶活性位点上的ASP305残基与决明子素C13羟基存在氢键作用，而VAL576、VAL306、PHE307、PHE571、TRP525五个残基与木犀草素甲基存在疏水相互作用（图9B）。决明子素的结合能为-8.1 kcal/mol。黄决明素的结合能最低，为-8.5 kcal/mol，这表明黄决明素对α-葡萄糖苷酶活性位点具有较高的亲和力和紧密的结合能力。从图9C可以看出，酶的ASP640和ASP305残基与黄决明素C6的羟基之间存在氢键作用，而酶的VAL576、PHE307、PHE571、TRP525残基与黄决明素间存在疏水作用。在所有的抑制剂中，黄决明素的对接能力最强。图9D展示了大黄素甲醚的分子对接模型。在α-葡萄糖苷酶活性位点上，酶的ASP640残基与大黄素甲醚C14的羟基之间存在氢键作用，而酶的VAL576、ASP305、PHE307、PHE571、TRP525、TRP423、PHE674和HIS700残基与大黄素甲醚之间存在疏水相互作用。大黄素甲醚的结合能为-8.1 kcal/mol。前4个具有较强对接能力的化合物在“3.3”中贡献排名前5。
图9 筛选出的的前4位抑制剂与α-葡萄糖苷酶相互作用的对接位点
A；橙黄决明素；B：决明子素；C：黄决明素；D：大黄素甲醚
讨论
1. 通过植物代谢组学对生和炒CS样品进行鉴别
作为一种强大的非靶向代谢组学策略，本研究将UHPLC-QTOF-MS/MS与植物代谢组学相结合，以区分生CS和炒CS。在没有事先鉴定的情况下，我们首次通过MPP软件分析发现共有1111种代谢物与生CS和炒CS之间的差异有关。在无监督数学模型PCA中，两组之间明显分离，表明植物代谢谱中的差异代谢物有助于区分生的和炒的CS样品。虽然主成分分析可以有效地提取主要信息，但它不够敏感，无法排除相关性较小的变量。因此，我们建立了PLS-DA模型，并对选定的差异代谢物进行了判别分析，这进一步证实了主成分分析结果。HCA结果表明，生的和炒的CS样品在代谢物含量或类型上存在显著的差异，这与PCA和PLS-DA结果相一致。在炒加工过程中，由于热等因素的影响，可能会造成化学成分发生变化，因此两组CS可以得到区分。据报道，在炒过程中，蒽醌糖苷的配基键的断裂会导致游离蒽醌的含量降低、结合蒽的醌含量增加。
2. 通过谱效关系分析发现潜在降血糖活性化合物
由于不同的化学成分可能导致不同的生物活性，我们进一步将谱效关系研究应用于CS药效学物质基础的筛选。目前，UPLC-QTOF-MS/MS指纹图谱分析具有分离效率高、分辨率高、灵敏度高等优点，已成为谱效关系研究的有力工具。在这项工作中，代谢组学建立的CS的UHPLC-Q-TOF/MS指纹图谱直接用于两谱效分析。由于降糖活性与α-葡萄糖苷酶密切相关，因此我们研究了生和炒CS对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。
在谱效关系的研究中，数学模型是反映指纹图谱和药效学数据内在相关性的一个极其重要的环节。近年来，许多统计方法（如GRA、BCA、PLSR）被用于研究光谱效应关系。每种统计分析都有其局限性和适应性。数据分析技术，GRA和BCA，经常结合用于研究谱效关系，以预测化学成分和药效学之间的相关性。然而，该方法无法描述各峰对应的组分对药效学指标的联合效应。PLSR可以分析每个组分对药效学的贡献，该方法结合GRA、BCA共同研究谱效关系，相辅相成，确保了结果的准确性和完整性。
GRA分析表明，生和炒CS中分别有26和23种成分与α-葡萄糖苷酶的抑制活性相关。BCA分析表明，α-葡萄糖苷酶抑制活性分别与生和炒CS的21和23个组分相关（P<0.05），其中13和14种呈正相关。此外，我们采用PLSR法评估了发挥α-葡萄糖苷酶抑制活性的主峰，其中生CS和炒CS分别有18和20个组分对α-葡萄糖酶的抑制活性有贡献（VIP>1）。整合从GRA、BCA和PLSR获得的结果，我们在生CS中发现了13种正相关的代谢物（决明子内酯龙胆二糖苷、红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、红镰霉素三葡萄糖苷、决明子苷、决明子苷C、去甲基红镰霉素-2-核苷-4-β-D-（6-O-乙酰基）-吡喃葡糖苷、红镰霉素-6-0-β-D-吡喃葡糖苷、橙黄决明素、决明子素、黄决明素、黄曲霉素、大黄素甲醚、大黄素），在炒CS中发现了14种具有降血糖活性的正相关成分（决明子内酯龙胆二糖苷、决明子苷B2、红镰霉素三葡萄糖苷、红镰霉素-6-O-β-龙胆二糖苷、决明子苷、决明子苷C、去甲基红镰霉素-2-核苷-4-β-D-（6-O-乙酰基）-吡喃葡糖苷、红镰霉素-6-0-β-D-吡喃葡糖苷、橙黄决明素、决明子素、黄决明素、黄曲霉素、大黄素甲醚、大黄素）。由此可见，除了决明子苷B2，从生CS和炒CS中筛选出的潜在降血糖活性成分相同。此外，在相同样品浓度下，除了去甲基红镰霉素-2-核苷-4-β-D-（6-O-乙酰基）-吡喃葡糖苷，炒CS的其他降血糖活性组分的峰面积高于生CS中的峰面积，反映出它们与α-葡萄糖苷酶抑制活性正相关。参考植物代谢组学提供的1111个生CS样品和炒CS样品之间的差异代谢物，14种潜在活性化合物均被鉴定为差异代谢品，表明它们的含量和/或化学类型上的差异。我们由此推测，CS的降血糖作用与蒽醌类和萘醌类化合物高度相关，这14种化合物具有作为CS质量控制主要指标的潜力。此外，通过分子对接分析，我们揭示了最重要的四种成分的潜在抑制机制，即大黄素甲醚、黄决明素、橙黄决明素和决明子素。
总之，本研究所提出的整合植物代谢组学和谱效关系分析的策略成功地识别了生和炒CS，并发现了潜在的降血糖活性成分，为CS的质量控制提供科学依据，从而保证其使用的有效性。
结论
在本研究中，我们首次以CS为案例，通过整合植物代谢组学和谱效关系分析，开发了一种发现潜在降血糖活性成分的策略。通过植物代谢组学方法，生CS与炒CS区可以很容易被区分。更重要的是，基于数学模型中的高估值，我们筛选出14种潜在的降血糖活性成分。此外，通过分子对接分析，我们系统地阐明了CS中潜在的活性成分对α-葡萄糖苷酶的抑制机制。综上所述，本方法可以作为区分生CS和炒CS、并评价其活性成分和整体机制的有效工具。
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