导读
蛭龙活血通瘀胶囊（ZHTC）是治疗缺血性脑卒中（中风）的有效中药复方，其广泛应用于临床缺血性脑卒中患者。然而，目前尚不确定ZHTC是否通过肠道微生物群和血清代谢产物影响缺血性脑卒中。在本研究中，我们构建了大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，通过评估运动神经功能评分、脑梗塞面积、脑组织损伤和肠屏障损伤，发现ZHTC改善了MCAO大鼠的卒中相关症状。使用16S rRNA基因测序、粪便微生物移植（FMT）、非靶向代谢组学以及肠道微生物群和血清代谢物的spearman相关性分析，我们发现ZHTC可以调节p_Firmicutes、p_Bacteroidota、p_Proteobacteria、g_Prevotella和g_Lactobacillus的丰度，并调节23种不同的代谢产物。Spearman相关分析发现精氨酸与p_Firmicutes、o_Clostridiales、c_Clostridia呈正相关，与p_Bacteroidetes、c_Bacteroidia、o_Bacteroidales呈负相关；L-赖氨酸与f_Christensenellaceae呈负相关；L-蛋氨酸与o_Lactobacillales、f_Lactobacillaceae和g_Lactobacillus呈正相关。综上所述，本研究首次表明ZHTC可通过调节肠道菌群和代谢紊乱来改善缺血性脑卒中。这为进一步揭示ZHTC、肠道微生物失调、血浆代谢产物水平与缺血性脑卒中之间的因果关系奠定了基础，并为ZHTC对缺血性卒中的改善作用提供了科学解释。
论文ID
原名：Zhilong Huoxue Tongyu Capsules’ Effects on ischemic stroke: An assessment using fecal 16S rRNA gene sequencing and untargeted serum metabolomics
译名：蛭龙活血通瘀胶囊对缺血性脑卒中的作用：粪便16S rRNA基因测序和血清非靶向代谢组学评价
期刊：Frontiers in Pharmacology
IF：5.988
发表时间：2022.11
通讯作者：杨思进，任维，蒲清荣
通讯作者单位：西南医科大学附属中医医院
实验结果
1. ZHTC改善MCAO大鼠运动神经功能，减少脑梗死面积和脑组织损伤
我们通过测量脑梗塞面积（图1A、B）和Zea Longa运动神经功能评分（图1C）来评估ZHTC治疗缺血性卒中的疗效。Zea Longa评分发现，模型组的评分显著高于假手术组。但服用ZHTC和尼莫地平后，评分显著降低。高剂量组的评分低于低剂量组和尼莫地平组。结果表明，ZHTC能改善MCAO大鼠的运动神经功能，高剂量的作用优于低剂量和尼莫地平。TTC染色结果显示，模型组梗死侧可见明显水肿和白色梗死区，表明模型已成功建立。给予ZHTC或尼莫地平后，脑梗死面积明显减小，且高剂量组脑梗死面积小于低剂量组。
此外，HE染色显示的脑组织损伤如图1D所示。假手术组：脑组织软脑膜结构完整，无明显炎性渗出；脑内神经元细胞形态正常，无明显变性坏死、炎性细胞浸润或胶质增生。模型组：结缔组织可见少量淋巴细胞；脑半球大面积坏死更为明显，坏死区轻度染色，坏死神经元核固缩、溶解，神经纤维蛋白溶解，大量胶质细胞增生，可见活化形态各种小胶质细胞和星形胶质细胞。高剂量组、低剂量组、尼莫地平组：脑组织软脑膜结构完整，未见明显炎性渗出。可见局部脑组织小面积变性和坏死，并伴有胶质细胞增殖。神经元的形态结构模糊，神经纤维溶解。结果表明，ZHTC和尼莫地平可减轻脑组织损伤。其中，与尼莫地平组比较，高剂量组神经元形态结构更接近假手术组，尼莫地平组脑组织损伤程度低于低剂量组。
图1 ZHTC改善MCAO大鼠运动神经功能，减少脑梗死面积和脑组织损伤
Zea Longa评分、TTC染色和HE染色结果表明，ZHTC和尼莫地平可改善MCAO大鼠运动神经功能，减少脑梗死面积和脑组织损伤，且ZHTC优于尼莫地平，且剂量越高，效果越好。
2. ZHTC对MCAO大鼠肠屏障损伤有改善作用
紧密连接蛋白连接连续的上皮层，限制细胞和细胞间营养分子的通过。它是生理屏障的重要组成部分。为了探讨ZHTC对MCAO大鼠肠道屏障破坏的影响，我们研究了紧密连接蛋白claudin-5、occludin-1和zo-1（图2A–D）。结果表明，与假手术组相比，模型组大鼠claudin-5、cocludin-1和zo-1蛋白的表达水平降低，表明缺血性卒中大鼠的肠屏障受损。ZHTC处理后occludin-1、claudin-5表达水平升高，且高剂量组疗效优于低剂量组。但zo-1的表达水平没有明显变化。尼莫地平增加了occludin-1蛋白的表达水平，但对claudins-5和zo-1没有影响。总之，这些发现表明尼莫地平不能完全逆转肠道屏障的破坏。ZHTC处理缺血性卒中可逆转紧密连接蛋白的表达，改善肠屏障的完整性。
图2 ZHTC对MCAO大鼠肠屏障损伤有改善作用
上皮层由绒毛和隐窝、上皮和内皮细胞组成，可防止外部不利因素的刺激和侵袭。它起着物理屏障的作用。我们进一步研究了绒毛长度、绒毛宽度和隐窝深度（图2E–I）。实验结果表明，模型组回肠绒毛的长度和宽度低于假手术组，隐窝的深度高于假手术组。ZHTC增加绒毛长度和宽度，降低隐窝深度，并增加绒毛长度与隐窝深度之比。尼莫地平能降低隐窝深度，但对绒毛长度和宽度没有显著影响。这表明缺血性卒中可导致肠屏障受损，ZHTC对肠屏障具有增殖和修复作用。
3. ZHTC改善MCAO大鼠肠道菌群失调
我们进行16S rRNA基因测序分析，以评估ZHTC对缺血性卒中大鼠肠道微生物群失调的影响。对肠道菌群组成差异的多层次分析表明，在菌门水平（图3A），五组中p_厚壁菌门和p_拟杆菌门的丰度最高，其次是p_变形菌门。其中，模型组p_变形菌减少，而高剂量、低剂量和尼莫地平组增加。与模型组比较，各给药组p_厚壁菌门和p_拟杆菌门均减少。在属水平上（图3B），g_Prevotella和g_Lactobacillus是五组中最丰富的。模型组的g_Prevotella显著低于高剂量组、低剂量组和尼莫地平组；g_Lactobacillus丰度显著高于高剂量组、低剂量组和尼尼莫地平组。结果表明，按其相对丰度排序，5组大鼠肠道菌群中均以p__Firmicutes、p__Bacteroidetes、g_Prevotella、g_lachnospiraceae、g_Ruminococcaeae为主要的菌群。
图3 ZHTC改善MCAO大鼠肠道菌群失调
为了全面评估微生物群落的α多样性，本研究使用Chao1指数来表征丰富度，使用Simpson和Shannon指数来表征多样性（图3C）。α多样性分析结果表明，低剂量组可以改变肠道菌群的丰富度和多样性。我们使用PCoA分析了β多样性的变化（图3D）。研究发现，模型组、高剂量组和低剂量组之间有明显区别，除了尼莫地平组与模型组之间有交叉。结果表明，ZHTC显著改变了肠道微生物群的β多样性和组成。这些数据表明，ZHTC可以改变缺血性卒中大鼠肠道菌群的多样性和组成，但尼莫地平没有这种作用。
图4 FMT可减轻卒中损伤并改变肠道菌群
接下来，为了进一步研究给药后肠道微生物群生物标志物的变化，我们进行了LEfSe分析，以确定微生物标志物（图3E–H）。与Sham组相比，模型组主要富含o_Bacteroidales、c_Bacteroidia、p_Bacteroidetes；与模型组相比，高剂量组和低剂量组主要富含f_Actinopolysporaceae、g_Bacillus、g_Nitrosomonas、o_Bacteroidales、p_Bacteroidetes、c_Bacteroidia，尼莫地平组主要富含o_Neisseries、f_Neisseriae、p_Proteobacteria。我们使用PICRUSt分析肠道微生物群的潜在功能（图3I，J）。与模型组相比，ZHTC干预改变了精氨酸和脯氨酸代谢、色氨酸代谢和其他代谢途径、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、磷酸戊糖途径、RNA降解、氧化磷酸化等。研究表明，ZHTC导致缺血性卒中大鼠肠道微生物群的功能差异。
4. FMT可减轻卒中损伤并改变肠道菌群
为了进一步研究肠道微生物群在缺血性卒中中的重要作用，我们通过灌胃法将高剂量组的粪便上清液给予模型组大鼠进行FMT实验。结果表明，FMT减少了MCAO大鼠的脑梗死面积（图4A、B）、运动神经功能评分（图4C）和脑组织损伤（图4D）。它可以增加occludin-1的表达水平，但对claudin-5和zo-1没有影响（图2A，4E–G）。它增加了绒毛长度、绒毛宽度、绒毛长度与隐窝深度之比，降低了隐窝深度（图4H–L）。但FMT组不如高剂量组有效。
我们对模型组、高剂量组和FMT组进行16S rRNA基因测序分析，以评估FMT对肠道微生物群的影响。结果表明，FMT改变了MCAO大鼠的肠道微生物群分布。多水平分析肠道菌群组成差异发现，在门水平(图4M），FMT组的p_Bacteroidetes、p_Actinobacteria和g_Revotella的数量显著高于模型组，并且p__Firmicutes、p__Poteobacteria和p__Tenericutes低于模型组。在属水平上（图4N），FMT组中的g_Bacteroidetes、p__Tenericutes和g__Prevotella的数量显著高于高剂量组，而p_Proteobacteria、p__Actinobacteria和p__Eluximicrobia低于高剂量组。FMT对alpha多样性没有明显影响（图4O）。PCoA显示FMT组和模型组显著分离，FMT组接近高剂量组（图4P）。此外，LEfSe分析(图4Q,R)发现，与模型组相比，FMT组主要富集于c__Elusimicrobia、f__Elusimicrobiaceae和o_Elusimicrobiales。与高剂量组相比，FMT组主要富含f_Clostridaceae_g_Clostridium和g_gemiger。
图5 ZHTC可改变MCAO大鼠血清代谢物
5. ZHTC可改变MCAO大鼠血清代谢物
为了探讨ZHTC改善MCAO大鼠的作用机制，我们进行了UHPLC-Q-TOF MS非靶向代谢组学分析。OPLS-DA模型的得分图（图5A、C、E、G）显示，正离子模式和负离子模式下的OPLS-DA模型可以区分模型组VS 假手术组、ZHTC组VS模型组。为了避免在建模过程中监督模型的过度拟合，我们使用置换检验来测试模型，以确保模型的有效性。图5B、D、F、H显示了正离子模式和负离子模式下模型组VS假手术组、ZHTC组VS模型组之间OPLS-DA模型的置换检验图。随着substitution retention逐渐减小，随机模型的R2和Q2逐渐降低。从结果图可以看出，该模型没有过拟合，并且该模型是可靠的。
表1 模型组与假手术组大鼠正负离子模式代谢产物差异
我们使用OPLS-DA VIP>1和p<0.05作为显著差异代谢物的筛选标准，挖掘具有生物学意义的差异代谢物分子。我们在模型组和假手术组中鉴定了14种不同的代谢物（表1），在ZHTC组和模型组中鉴定出23种不同的代谢产物（表2）；通过Fisher精确检验分析和计算每个途径的代谢产物富集的显著性水平，以确定受到显著影响的代谢和信号转导途径（图4I，J）。研究发现，模型组存在重要的代谢途径，包括β-丙氨酸代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢以及鞘磷脂信号通路。ZHTC组的重要代谢途径是精氨酸生物合成、谷氨酸能突触、精氨酸和脯氨酸代谢、酪氨酸代谢、D-精氨酸与D-鸟氨酸代谢、突触囊泡循环、多巴胺能突触、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢。
表2 ZHTC组和模型组之间正离子和负离子模式的差异代谢物
6. 微生物多样性与血清代谢物的Spearman相关分析
为了评估肠道微生物群和代谢产物之间的相互作用，我们对ZHTC组和模型组之间的差异细菌和代谢产物进行了Spearman相关分析。研究发现，大多数血清代谢物与肠道微生物群之间存在显著相关性（图6A，B）。其中精氨酸与p_Firmicutes、o_Clostridiales、c_Clostridia呈正相关，与p_Bacteroidetes、c_Bacteroidia、o_Bacteroidales呈负相关；L-赖氨酸与f_ Christensenellaceae呈负相关；L-蛋氨酸与o_Lactobacillales、f_Lactobacillaceae和g_Lactobacillus呈正相关。结果表明，ZHTC对缺血性脑卒中的改善与肠道菌群及其代谢产物的变化有关。
图6 微生物多样性与血清代谢物的Spearman相关分析
讨论
在本研究中，我们发现通过Zea Longa运动神经功能评分和TTC染色成功地建立了MCAO模型。ZHTC处理后，运动神经功能显著改善，脑梗死面积和脑组织损伤显著减少，说明ZHTC能有效改善缺血性脑卒中的症状。肠道屏障是肠道微生物组和大脑之间的联系。为了保持肠屏障的结构和功能完整性，紧密连接蛋白如claudin-5、occludin-1和zo-1在肠组织中的表达起着重要作用。紧密连接蛋白表达水平的检测不仅可以反映肠屏障的损伤，还可以反映肠黏膜屏障的恢复程度。claudin蛋白的表达增加可以抑制细菌在肠粘膜上的粘附，防止上皮细胞通透性增加，保护肠粘膜屏障功能。这项研究发现，缺血性卒中大鼠的肠屏障被破坏。Ococcludin-1、claudin-5通过ZHTC治疗恢复，这表明ZHTC通过增加紧密连接蛋白的表达水平来改善肠屏障的完整性。此外，小肠绒毛是小肠壁的屏障。绒毛上皮细胞处于持续更新状态。在正常条件下，它们具有很强的增殖和修复能力。它们可以在损伤后24小时内修复，以维持绒毛的正常组织结构。绒毛的长度和宽度可用于判断肠粘膜的损伤程度和增殖修复能力。绒毛长度和宽度越大，肠粘膜损伤越小。肠隐窝是肠上皮向绒毛根部固有层下沉形成的管状腺体，在相邻绒毛之间打开。隐窝深度的增加会削弱肠粘膜修复能力，无法阻止有害细菌在肠道内定植。因此，绒毛长度与隐窝深度的比值越高，对肠粘膜的保护越好。我们的研究结果表明，缺血性卒中可通过减少绒毛长度、绒毛宽度、绒毛长度与隐窝深度的比率以及增加隐窝深度而导致肠粘膜损伤。然而，ZHTC通过逆转上述情况对肠粘膜具有促增殖和修复作用。这些结果表明，ZHTC可以改善缺血性中风大鼠的中风症状和肠屏障。
基于ZHTC对MCAO大鼠中风症状和肠屏障的改善作用，我们研究了ZHTC对缺血性卒中肠道菌群的影响。在这项研究中，我们发现ZHTC可以通过调节肠道微生物群的组成来缓解缺血性卒中。在门水平，它调节厚壁菌门、拟杆菌门和变形杆菌门的丰度。在属水平上，它可以调节普雷沃氏菌和乳杆菌的丰度。人类肠道菌群主要由厚壁菌门和拟杆菌门组成，其余主要为放线菌门、变形菌门和疣微菌门。Spychala等人发现了中风后小鼠肠道微生物群的失调，导致厚壁菌门与拟杆菌门的比率增加。另一项使用MCAO小鼠中风模型的研究发现，严重中风后3天，肠道微生物群组成发生了显著变化，主要表现为物种多样性降低和拟杆菌过度生长。中风后，脑梗死患者肠道菌群发生明显变化，肠道内条件致病菌如肠杆菌科、f_Veronicaceae、链球菌科等明显增多，普雷沃菌属、拟杆菌属等定植菌明显减少。一项对93名缺血性中风患者的研究表明，普雷沃氏菌和乳杆菌的丰度与中风后的认知障碍有关。Yamashiro等人评估了中风患者的粪便微生物群和粪便有机酸，他们发现缺血性卒中与乳酸杆菌数量减少有关。值得注意的是，我们的研究结果还发现，厚壁菌门、拟杆菌门、普雷沃氏菌门、毛螺菌科和瘤胃球菌科是五组大鼠肠道菌群中的优势菌株，而ZHTC可以逆转MCAO大鼠的上述肠道菌群。FMT后，我们发现FMT组与高剂量组具有相同的效果。与模型组相比，其在运动神经功能评分、脑梗死体积和脑组织损伤方面表现明显更好。与模型组相比，FMT组的大鼠减少了肠道屏障的损伤，并改变了肠道微生物群。这些结果表明，FMT处理对脑卒中引起的微生物群落变化有一定的恢复正常作用，可能对脑卒中后的神经保护有一定的药效。结果表明，ZHTC对缺血性脑卒中大鼠的保护作用是通过肠道菌群介导的。
在证明ZHTC在改善缺血性卒中预后和调节肠道微生物群紊乱中的作用后，我们对其潜在机制进行了非靶向代谢组学研究。ZHTC处理共改变了23种不同的代谢产物。在本研究中，精氨酸与p_Firmicutes、o_Clostridiales、c_Clostridia呈正相关，与p_Bacteroidetes、c_Bacteroidia、o_Bacteroidales呈负相关。据报道，精氨酸是一种非必需氨基酸，可改善脑缺血大鼠的脑血流和代谢，减少梗死体积。并且精氨酸通过抑制脑缺血/再灌注损伤后HIF-1α/LDHA介导的炎症反应，具有神经保护作用。补充精氨酸可改善肠道损伤和肠道免疫力。精氨酸通过细胞因子和肠道微生物群促进肠道健康，减少肠道厚壁菌群对糖脂代谢的影响，进而改变肠道微生物组成。此外，L-赖氨酸与f_Christensenellaceae呈负相关。赖氨酸是一种碱性氨基酸。在小肠隐窝和结肠中，组蛋白H3在赖氨酸18处的巴豆酰化是一种异常丰富的修饰，微生物群衍生的短链脂肪酸通过组蛋白脱乙酰酶促进结肠中的组蛋白巴豆酰化。口服赖氨酸和精氨酸对大鼠大脑中动脉短暂性闭塞/再灌注所致脑梗死具有神经保护作用。L-蛋氨酸与o_Lactobacillales、f_Lactobacillaceae、g_Lactobacillus呈显著正相关。研究发现，蛋氨酸可以通过调节细胞壁重塑来提高乳酸乳杆菌F44的耐酸性和乳酸链球菌素的产量。S-腺苷-L-蛋氨酸通过减少血脑屏障破坏和神经元死亡，对缺血性损伤的预后具有有益的影响。它还可减轻永久性局灶性缺血和全脑缺血再灌注大鼠脑的氧化应激损伤。我们的研究表明，精氨酸、L-赖氨酸和L-蛋氨酸可能是缺血性卒中的重要生物标志物。它们在中风中的代谢以及它们与肠道菌群的关系为我们下一步的研究奠定了基础。
结论
总之，我们的研究初步证实了ZHTC可以改善缺血性卒中，这一机制与维持肠道微生态稳态和调节代谢紊乱有关。这为ZHTC在缺血性脑卒中治疗中的临床应用提供了一定的科学依据，也为进一步阐明其潜在机制奠定了基础。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36467061/
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