加州大学金海瓴团队升级喷雾诱导基因沉默(SIGS)技术: 使用纳米囊泡递送dsRNA提高植物抗病性

作物病害绿色防控对保障我国粮食安全和农业可持续发展具有重大意义。真菌植物病害是对全球粮食安全的主要威胁，导致全球常年作物产量损失高达20%，采后产品损失高达10%。目前应用最广泛的植物病原体控制措施是应用杀菌剂。为了保障全球粮食安全，必须开发另一种环保的真菌控制方法。最近的研究表明，许多具有侵袭性的真菌病原体可以从环境中吸收RNA，这些RNA可以诱导具有互补序列的真菌基因的沉默。这一发现推动了SIGS的发展，其中真菌毒力基因靶向双链RNA（dsRNAs）或小RNA（sRNAs）被应用于植物以控制真菌病原体。

近日，加州大学滨河分校Hailing Jin团队在Plant Biotechnology Journal杂志发表了题为“Artificial nanovesicles for dsRNA delivery in spray induced gene silencing for crop protection” 的研究论文。该研究通过使用人造纳米囊泡（AVs）包裹dsRNA ，可以克服SIGS中的dsRNA不稳定性，有效防止核酸酶降解和被叶片冲洗去除，提高对收获前和收获后植物材料的对抗灰孢杆菌的保护时间。

图1 人造纳米囊泡可以保护并有效地将dsRNA传递给真菌病原体灰霉菌（Botrytis cinerea）

人造纳米囊泡可以保护并有效地将dsRNA传递给真菌病原体灰霉菌。作者尝试并确定了AVs与dsRNA 4:1的最佳比例，并且 AVs可以保护dsRNA有效阻止被微球菌核酸酶（MNase）对其降解。使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）比较了真菌对裸体和AVs包裹的荧光素标记的dsRNA的摄取，在加入AV-dsRNA后，在菌丝上和菌丝内发现了较强的荧光信号，表明AV-dsRNA被真菌细胞所吸收。

作者检测了AV-dsRNA的应用是否触发了灰霉菌中的RNAi。将不包裹AVs的dsRNA和AV-dsRNA外应用于多种植物材料，包括番茄、葡萄、莴苣叶片和玫瑰花瓣，观察到灰霉菌的毒力降低，用真菌基因（Bc-DCL1/2或Bc-VDS）的dsRNA和AV-dsRNA处理的植物材料的症状明显减少。

图2 外用dsRNA或AV-dsRNA抑制病原体毒力

AV-dsRNA通过增加dsRNA的稳定性和持久性，扩展了rRNA介导的抗灰霉病效果。评估洗涤对AV-dsRNA在拟南芥叶片上的稳定性和粘附的影响，使用荧光素标记的Bc-VDS-dsRNA和Northern blot检测叶片表面的dsRNA含量，发现冲洗后dsRNA处理的组合显著下降并明显低于AV-dsRNA处理的组合。作者还发现AV-dsRNA可以稳定的存在10天，且加AV-dsRNA组合中抗灰霉菌的效果随着时间降低的要慢很多。总之，AV-dsRNA在植物叶片上的粘附性和稳定性比dsRNA强，抗灰霉菌的时间更持久。同样的实验也在番茄、葡萄和葡萄叶片得到了相同的结论。清楚地表明了AVs如何保护dsRNA不被降解，从而延长植物对抗灰霉菌的时间。

图3 AV-dsRNA处理可延长对番茄、葡萄和葡萄叶片的抗灰霉菌的水平

成本是任何作物保护策略的关键考虑因素，因此作者接下来检测了是否更具成本效益的AV制剂可以用于dsRNA递送和RNAi活性。不使用PEG并使用了一种更便宜的阳离子脂质DODMA，与胆固醇以2：1的比例形成DODMA-Avs。检测发现，DOTAP和DODMA都能有效保护Bc-VDS dsRNA免受核酸酶降解。检测DOTAP+PEG，DOTAP和DODMA用于包裹dsRNA的三种脂质组合是否会影响真菌对dsRNA吸收或RNAi活性，结果表明DOTAP+PEG和DODMA AV的摄取速度略快。在采摘后的番茄中也进行了实验。与此同时，没有发现Avs对植物有其他副作用毒性。

图4三种脂质类型的AVs可保护 dsRNA 免受核酸酶降解，并且容易被灰霉菌吸收

脂质体（liposome）在科研和临床中有广泛的应用，本文首次证明了纳米囊泡也可以用于农业环境中，以将dsRNA传递到植物抵抗病原体侵害。其优势在于延长保护时间和效率，降低成本，使SIGS成为一种在生长和成熟后更可行的作物保护策略。有助于减少田间喷洒的化学杀菌剂的数量，并为限制真菌病原体对作物生产和粮食安全的影响提供一个可持续的选择。

原文连接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.14001

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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