重组（CO）通过确保染色体的正确分离，在第一次减数分裂期间发挥关键的作用。减数分裂中发生的重组始于DNA双链断裂（DSB）的形成。在这个阶段中会发生多轮链末端侵入、延伸和置换，并产生复杂的重组中间体。许多这些中间体被DNA解旋酶解离，并通过合成依赖性链退火（SDSA）进行修复。SDSA确保在减数分裂中只有非常短的DNA片段发生错误的复制。重组通常发生在称为重组热点的有限的染色体区域。同源染色体之间的序列多态性也可能导致重组中间体中的碱基对错配，从而影响重组结果。在减数分裂重组过程中检测此类错配通常取决于是否包含MSH2的MutS异二聚体。MSH2异二聚体结合错配以防止复制后突变，而它们通常在重组过程中触发异源双链体排斥。进一步研究表明MSH2异二聚体可能在减数分裂重组中发挥不同的功能。
在植物中对于重组热点的研究较少。已知植物中的重组热点主要位于基因启动子和终止子中，并与活跃的染色质修饰相关，包括低核小体密度、H3K4me3和DNA甲基化。因此，重组热点在着丝粒周围区域分布较少。着丝粒周围倾向于表现出更高水平的碱基多态性，表现为更多结构变异的存在和更高密度的单核苷酸多态性（SNP）。重组也是种群遗传多样性的主要来源，并且在很大程度上塑造了植物对不同环境的适应性。因此，遗传多样性与减数分裂重组之间的关系尤为重要。尽管对于重组进行了多年的研究，但对于碱基多态性如何影响重组的分布，作者仍知之甚少。
近日，波兰波兹南密茨凯维奇大学分子生物学和生物技术研究所Piotr A. Ziolkowski团队在Nature Communications上发表题为“The effect of DNA polymorphisms and natural variation on crossover hotspot activity in Arabidopsis hybrids”的研究论文，作者开发了基于种子的分型方法来研究拟南芥的重组热点，通过分析msh2突变体中的重组热点，发现MSH2通过影响多态性区域的重组热点来塑造重组的分布。
首先，作者开发了一个精确的重组映射系统，可以在热点范围内对重组进行准确的分析。该方法基于一个极短的中间系 (ESIL)，它携带在种子中表达的荧光报告基因，间隔不超过50 kb。荧光标记的间隔提供精确的重组频率测量和基于种子荧光的重组体检测。作者使用最近在拟南芥中开发的大规模荧光报告系，通过在 Col-0 背景中选定一些单色报告系来进而进行杂交来构建五个ESIL。这些间隔位于靠近端粒的3号染色体臂、间质形成相邻间隔，或位于着丝粒周围区域（ChP）。为了评估ESIL在较小尺度重组分析中的适用性，作者使用了已发布的超高密度重组图谱，该图谱是为拟南芥Col-0和Ler-0种质之间的杂交创建的。作者绘制了3号染色体的重组图谱，窗口大小为20 kb，并叠加了五个ESIL的间隔位置（图1a）。值得注意的是，ChP间隔与1169个窗口中3号染色体上三个最高重组位点之一重合（图1a）。接下来，作者将ESIL与拟南芥种质Col-0、Ct-1和Ler-0杂交，以测量近等基因系中的重组频率（图1b）。在近交系中，所有间隔均显示3.5cM/Mb 或更高的平均重组频率。相比之下，着丝粒周围ChP区间表现出最高的重组频率（平均值为 9.09cM/Mb）（图1b）。这与之前的观察结果一致，即多态性的存在不会抑制重组（图1b）。
由于其着丝粒周围的区域表现出最高密度的多态性。这种高度的多态性加上其非常高的重组频率，使ChP成为重组事件高分辨率绘图的优秀系统。为了确定ChP区间内潜在重组热点的位置，作者开发了基于种子分型方法，其中选择来自F2重组种子，基于单个荧光报告基因的表达来指示重组事件的发生位置（图1c和d）。
作者确定了242个在26.3 kb区域不均匀分布的重组，发现了三个明显分离的热点，作者将其命名为Aro（8.8kb）、Coco（4.6kb）和Nala（3.4kb）（图1e和f）。这些热点的重组频率不同：Aro 占已识别重组事件的32%，Coco占60%，Nala仅占8%。每个重组热点的活动可以通过将这些值与整个间隔的重组频率测量相关联来确定（图1b和c）。每个热点显示的重组频率均远高于基因组平均值，Coco达到62.14 cM/Mb。
图1：基于种子分型重组分析。
尽管ChP具有高度的碱基多态性，但重组倾向于发生在多态性相对较少的地方。相对于该区间的其余部分，热点并未显示DSB的数量增加（图 2）。作者分析了 ChP 间隔期间各种染色质修饰的概况，并观察到重组热点与开放染色质结构、高组蛋白乙酰化和 H2A.Z的存在相关（图2）。值得注意的是，Coco热点显示出高水平的H3K4me2，但不是 H3K4me3（图2）。
图2：ChP间隔的染色质修饰图谱。
ChP间隔内三个不同的重组热点使其成为评估热点之间的竞争和拟南芥种质之间重组图谱的理想模型。从种子评分分析中可以发现，只有Col-ChP × C24显示出与近交系没有统计学差异的重组频率（平均分别为 8.73 和 8.54，图3d）。序列分析表明，C24在与 Coco热点重叠的位置携带1194bp的缺失（图3c）。使用Col-ChP × C24种子分型，作者观察到Coco内重组事件数量的显着下降（图 4a和b）。尽管作者观察到缺失附近的重组数量急剧减少，但作者检测到了基因组附近的重组事件，表明Coco热点仍保留其部分活性。有趣的是，位于Coco两侧的两个热点Aro和Nala的重组活性并未因较低的Coco活性而增加（图4c）。这一观察表明，紧邻的热点之间没有竞争；然而，这一结论可能会被 Ler和C24之间重组的可变性所掩盖，例如反式作用重组修饰剂的存在。为了消除这种可能性，作者使用一对sgRNA删除了Ler中 Coco 的中心活跃部分。获得了两个分别缺失714bp（LerΔ#24）和825bp（LerΔ#76）的敲除系，然后作者将它们和Col-ChP系进行杂交（图 4d）。与 Col-ChP × Ler对照相比，两个杂交都显示重组频率降低了大约两倍（图 4e）。Col-ChP × LerΔ#24 的种子分型显示缺失附近区域的重组事件显着减少（图 4f和g）。这一结果证实了拟南芥重组热点相互独立运作，不存在短距离热点竞争。
图3：InDel和结构变异对ChP区间内重组频率的影响
图4：ChP内重组热点的保守性和竞争性。
由于SNP相关的重组依赖于MSH2，作者检查了MSH2的基因失活将如何影响ChP 和BT间隔中的重组，后者具有比ChP更低的SNP密度（3.58和14.20 SNPs/kb；图 1a）。作者将msh2-2突变回交到Col-ChP系，并测量了 Col-ChPmsh2 × Colmsh2近交系中的重组频率。重组频率与具有MSH2的野生型相同（图 5a）。然后，作者使用Cas9介导的基因编辑在Ler背景中的MSH2处引入突变，并获得了Col-ChPmsh2 × Lermsh2杂合体。这种msh2 杂合体显示出比相应的野生型杂种（Col-ChP × Ler）显著更低的重组速率（图 5a）。接下来，作者研究了msh2近交系和杂交种的BT重组率（图 5b）。与msh2的ChP类似，msh2的BT近交系与野生型相比没有变化。然而，与 Col-ChPmsh2 × Lermsh2 杂交种相反，Col-BTmsh2 × Lermsh2显示出明显高于其对应野生型重组频率。这些结果表明，在ChP和BT杂交种中观察到的重组水平的MSH2依赖性变化受染色体尺度上重组分布的影响，而不是多态性的局部效应。
图5：SNP、msh2突变和HEI10过表达对重组频率的影响。
接下来，作者分别确定了来自Col-BT × Ler和Col-BTmsh2 × Lermsh2杂交的185和196 重组体的精确重组位点。为此，作者使用五个重叠的LR-PCR扩增子开发了BT间隔的种子分型。BT重组图谱与ChP区间的图谱非常不同，前者包含许多彼此靠近的热点（图 6a到c）。由于 SNP 密度低得多和基因密度高，无法清楚地区分它们（图7）。因此，作者根据多态性模式和H2A.Z峰的出现将BT间隔分为13个2.6到5.2 kb的非重叠部分（图6d）。作者从分析中排除了三个部分，因为它们不包含重组事件。然后作者计算了每个部分相对于野生型的Col/Ler多态性密度和msh2重组活性。与ChP一样，作者还观察到BT在多态性水平与msh2中重组活性变化之间存在明显的关系（图 6e）。在高度多态性的部分11和9中，msh2突变体显示出比野生型更少的重组事件，而突变体在含有少于 8个SNP/kb的部分中具有更多的重组。有趣的是，在第10部分中，SNP密度只有0.6 SNP/kb，msh2中的重组事件数量是野生型的四倍多，这表明在没有功能错配检测的情况下，重组事件主要发生在无多态性的重组热点中。msh2重组频率的变化与野生型和多态性密度之间的关系具有统计学意义。这部分结果表明，MSH2增加了被更多SNP包围的热点中出现重组的机会。重要的是，这种效应与错配识别缺陷背景中染色体间隔的重组频率是增加还是减少无关（图5a和b）。
图6：msh2突变对BT区间内重组分布的影响。
图7：BT间隔中的染色质修饰图谱。
作者对野生型和msh2中ChP和BT重组的比较是基于对整个基因组具有多态性的F1 个体的分析。因此，测得的重组反映了多态性的局部和染色体尺度效应。为了仅研究同源区间内多态性对ChP中重组形成的直接影响，作者利用了作者系统的一个独特特征，该特征允许通过连续几代在下游分析中使用重组体（图1c）。对于种子分型，作者对3周大的植物进行了采样，这使得重组体能够进一步生长并产生后代。基于已识别的重组位点，作者选择了具有绿色或红色荧光的Col-ChPmsh2 × Lermsh2重组体并将它们杂交（图8a）。从他们的后代中，作者选择了F2种子，其中荧光标记之间发生了新的重组事件，从而将两个记者带到同一条染色体上，在它们之间插入了一个Ler片段。然后作者将这些系回交到 Col系。结果，作者获得了R2（Recombinant× Recombinant）系（图8b）。重要的是，在整个区间携带Col/Ler多态性的所有R2系ChP重组频率均显着高于ChP近交系和杂交种（图 8c）。仅在Coco热点内杂合的系也具有比纯近交系显着更高的ChP重组率。该结果表明 MSH2促进了基于局部发生的同源区段内多态性的单个热点中的重组。
图8：碱基多态性对ChP间隔内MSH2依赖性重组的直接影响。
总的来说，作者的研究表明，尽管重组往往发生在没有多态性的热点中心，但紧重组邻热点的SNP会被MSH2检测到，从而刺激这些重组热点的重组活性。
在讨论中，作者写道：据估计，多达20%的植物主要是自交，包括模式植物拟南芥和重要的单子叶和双子叶作物，如小麦、水稻和番茄。纯合基因组中的杂合区域是在单个个体和种群规模上唯一可用的变异来源，这些杂合区域是从偶尔的异交和随后的多轮近交中出现的。也许这就是为什么减数分裂重组针对自交植物中的杂合子区域，正如现在在拟南芥中所证明的那样。作者的分析揭示了同源区段内多态性的MSH2依赖性检测如何在单个重组热点的范围内塑造染色体重组模式。这一模式可能对自花授粉植物物种的进化至关重要。
转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号
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