重大进展！研究利用纳米孔技术直接读取蛋白质序列

DNA序列是蛋白质一级序列信息的重要来源。然而，由于它们不直接编码有关蛋白质丰度或蛋白质翻译后修饰和剪接的信息，因此 DNA 基因组和 RNA 转录组都不能完全描述蛋白质表型。在单分子水平上直接识别蛋白质和检测翻译后修饰的方法将极大地有益于蛋白质组学研究。Science杂志在线发表了来自荷兰代尔夫特理工大学Cees Dekker课题组题为“Multiple rereads of single proteins at single–amino acid resolution using nanopores”的研究论文。该研究首次基于纳米孔技术，以单氨基酸的分辨率，对蛋白质一级序列进行了直接读取，该概念验证实验为开发单分子蛋白质指纹图谱和分析技术奠定了基础。

纳米孔测序技术是更新一代的长读长/超长读长单分子测序技术，支持无需PCR扩增的直接DNA以及RNA测序，保留碱基修饰的同时可消除扩增带来的偏好性，可实时进行碱基识别和数据分析。其原理当长链DNA分子通过纳米尺寸的空隙时，不同碱基会产生相应的电流变化。而通过仪器识别这种电流变化，就可以反推出相应的碱基，从而还原DNA的序列。如下视频所示。此外，纳米孔也可用于蛋白质指纹识别或测序，小肽片段通过孔自由易位的方法已显示出对单个氨基酸的敏感性，但缺乏确定氨基酸顺序和重建单个蛋白质序列的方法。

视频来源：nanopore

该研究开发了一个系统，其中 DNA-肽偶联物被在 DNA 切片上行走的解旋酶拉过生物纳米孔。共轭链由 80 个核苷酸的 DNA 链组成，该链通过 DNA 5' 端的 DBCO click 接头共价连接到 26 个氨基酸的合成肽，连接到肽 C 端的叠氮化物修饰。此外，选择主要由天冬氨酸 (D) 和谷氨酸 (E) 残基组成的带负电荷的肽序列，以便电泳力有助于将肽拉入孔中。此外还使用了具有杯状形状的突变纳米孔 M2 MspA，将解旋酶与离子电流阻塞发生处的孔收缩区隔开约 10 nm 。对于 DNA 易位运动酶，使用 Hel308 DNA 解旋酶，其以更小的半核苷酸步骤将聚合物拉过 MspA，使其具备识别单个氨基酸取代的能力。具体如下：

进一步，该研究基于纳米孔的方法获得的数据，可以以高保真度和高通量潜力区分单个氨基酸敏感性的单个肽。虽然它目前无法进行蛋白质从头测序，但这种纳米孔肽阅读器提供了有关肽一级序列的位点特定信息，可用于单分子蛋白质指纹识别和变异识别。未来将其转化为能够进行蛋白质从头测序的技术仍然是一项重大挑战。总体而言，该研究结果是朝着低成本方法迈出的第一步，该方法能够在浓度敏感性的最终极限下进行单细胞蛋白质组学，在基础生物学和临床中都有广泛的应用。

论文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abl4381#con5

转自：“iPlants”微信公众号

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