2023年杨辉首篇文章

碱基编辑技术是基于CRISPR/Cas系统发展起来的新型靶基因修饰技术，可以在不切断核酸骨架的情况下实现单核苷酸定点突变，在基因组和转录组编辑过程中能够直接化学修饰靶核碱基。碱基编辑器主要可分为DNA编辑器和RNA碱基编辑器。DNA碱基编辑能够对基因组进行不可逆的、永久的改变，而RNA碱基编辑则对细胞遗传物质进行可逆修改或RNA表观转录修饰。DNA碱基编辑器可以进一步分类为胞嘧啶碱基编辑器（Cytosine base editor，CBE）或腺嘌呤碱基编辑器（Adenine base editor，ABE）；其中CBE能够将DNA 的A、T、C和G四种碱基中的靶位点C•G向T•A转变，而ABE则可将靶位点的A• T转变成G•C。

随着碱基编辑系统的开发及不断的优化发展，目前，已经开发出第4代碱基编辑器（BE4）、无RNA的DddA衍生型胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE）、能够编码单个TadA域的ABE8e等DNA编辑器；以及REPAIR、RESCUE等RNA编辑器。然而，还没有一种碱基编辑器能够实现A-to-T和/或A-to-C这类碱基之间的颠换（即嘌呤变嘧啶）。导致人类产生遗传疾病的单点突变中，约四分之一的致病突变的修复需要实现腺嘌呤碱基的颠换（A-to-T和A-to-C；或互补链的T-to-A和T-to-G）。因此，开发能够实现腺嘌呤碱基颠换的新型DNA碱基编辑器对基础研究及基因治疗领域都有着重大的潜在价值。

2023年1月9日，中国科学院神经科学研究所杨辉课题组和临港实验室/上海脑科学与类脑研究中心胥春龙课题组合作在Nature Biotechnology上发表了题为“ Programmable A-to-Y base editing by fusing an adenine base editor with an N-methylpurine DNA glycosylase ”的研究论文，该研究开发了一个腺嘌呤碱基颠换编辑器（AYBE，Y = C or T），用于哺乳动物细胞中A-to-C和A-to-T转基编辑，通过融合腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor，ABE)和次黄嘌呤切除蛋白N-甲基嘌呤DNA糖化酶(N-methylpurine DNA glycosylase，MPG)。研究还设计了AYBE变体，能够在基因组位点上进行靶向编辑，具有更高的转化编辑活性(A-to-C或A-to-T编辑活性高达72%)。

总之，该研究首次实现了高效的腺嘌呤碱基颠换编辑，对于基础研究领域疾病模型的建立及基因治疗领域等都有着至关重要的意义。

利用A-to-T报告系统及A-to-C报告系统都检测到了腺嘌呤碱基的有效颠换编辑，并发现与另外两种融合原型相比，将野生型MPG融合在ABE8e的C端（TCM，称为AYBEv0.1）获得了最高比例的阳性编辑。

为了提升AYBE的腺嘌呤颠换编辑活性，研究人员利用上述报告系统在哺乳动物细胞中对AYBE中的MPG组分开展了逐步的优化。通过设计了多种工程化改造方案，经过多轮的突变筛选获得了腺嘌呤颠换编辑效率较高的突变体。利用报告系统评估，AYBEv3版本的腺嘌呤颠换编辑效率达到了初代版本AYBEv0.1的4.78倍。在基因组内源位点上，各个突变体的颠换编辑效率分别为A-to-T的编辑从 5.88%提高到了 15.49%，A-to-C的编辑从 14.42%提高到了 30.98%，而且AYBEv3有着与AYBEv0.1相当的低indels频率。

图1. AYBE的流程与优化（图源自Nature Biotechnology ）

研究人员进一步在基因组内的35个靶点对AYBEv3作了综合评估，发现其可实现高达72%的颠换编辑效率（其中个别位点A-to-C的颠换效率可达53%，纯度可达70%）。AYBEv3在A7、A8这两个位置及CAA和CAG这两种基序有着最高的颠换编辑效率。另外，AYBEv3在多种哺乳动物细胞类型中都能有效的实现腺嘌呤的颠换编辑。

通过对gRNA依赖的及gRNA非依赖的脱靶分析，研究人员发现与ABE8e相比，AYBEv3的DNA脱靶水平更低。该研究也进一步通过建立稳转细胞系探究了AYBEv3在一些疾病相关突变位点上的应用潜力。研究人员发现基因DMD和SLC26A4中提前终止密码子的突变及基因ATM和TTN中内含子剪接位点处的突变可以使用AYBEv3得到有效的纠正。

图2. 通过高通量目标测序鉴定AYBE的编辑特征（图源自Nature Biotechnology ）

通过引入DNA损伤修复蛋白Polη（一种在跨损伤DNA复制过程中倾向于在AP中间体对侧添加A的DNA聚合酶），大大提高了A-to-T的编辑效率和纯度，为进一步开发更精准的ATBE或ACBE提供了新的策略。

总的来说，该研究开发的腺嘌呤碱基颠换编辑器（AYBE），虽然AYBEv3的编辑效率及纯度仍需进一步提高，腺嘌呤颠换碱基编辑器的开发填补了目前碱基编辑器不能高效实现A-to-C或A-to-T的空白。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41587-022-01595-6

转自：“iNature”微信公众号

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