细胞焦亡是一种炎症相关程序性细胞死亡的方式，由gasdermin蛋白家族的成员介导。Gasdermin家族成员具有相似的N末端结构域，能被裂解的半胱天冬酶或颗粒酶切割，从而引起细胞膜穿孔导致细胞焦亡。在过去的研究中，细胞凋亡已被广泛认为是作为调节抗肿瘤治疗反应中细胞死亡的机制。近几年，焦亡逐渐成为研究的热点之一，同时也被证实在化疗、靶向治疗和免疫治疗中可能具有抗肿瘤效果。
泛素化和去泛素化是调节各种关键细胞过程的重要翻译后修饰方法。去泛素化是泛素化的功能互易过程，通过去泛素化酶（DUB）介导的从靶蛋白中去除泛素链来防止蛋白质蛋白酶体降解。卵巢肿瘤家族去泛素酶4（OTUD4）是OTU家族的成员，优先切割K48缀合的多泛素链，并参与多种蛋白质的去泛素化。最近的研究表明，OTUD4在多种人类肿瘤类型中被确定为下调，较低的OTUD4表达表明肿瘤治疗的预后不良。因此，对OTUD4的表达和功能进行深入的研究可能为肿瘤的治疗提供潜在的靶点。
研究背景
Research Background
鼻咽癌（NPC）是一种源于鼻咽上皮的恶性肿瘤，其最主要的治疗方法就是放射疗法（RT）。基于调强放射疗法（IMRT）的广泛运用，NPC患者的局部疾病控制和整体的存活率都显著上升。尽管如此，仍有17%左右的NPC患者会出现复发的情况。其中，放射耐受是阻止NPC成功治愈的主要因素之一。因此，阐明NPC放射耐受的机制对鼻咽癌的治疗有着至关重要的作用。
以前的研究多数集中在细胞凋亡缺陷作为放射耐药的机制，而缺乏对其他细胞死亡模式在调节鼻咽癌放射敏感性的探索，这也是本文作者想要研究的问题。
研究成果
Research results
2022年11月21日，中山大学肿瘤中心的王林等在Journal of experimental & clinical cancer research : CR（IF=12.658）杂志上发表了题为“OTUD4-mediated GSDME deubiquitination enhances radiosensitivity in nasopharyngeal carcinoma by inducing pyroptosis”的文章。在该研究中，作者发现放疗通过内在线粒体凋亡途径诱导鼻咽癌细胞中的GSDME依赖性的细胞焦亡。低GSDME表达通常代表着更差的预后，并且与体外和体内的放射耐受性有关。此外，作者证明了OTUD4去泛素化和稳定GSDME，通过促进GSDME依赖性焦亡来增强鼻咽癌的放射敏感性。这些成果为研究放射敏感性指明了可能的方向，并通过靶向焦亡为使鼻咽癌对放疗敏感开辟了新的途径。
DOI号:10.1186/s13046-022-02533-9
研究过程与结果
Research Process and Results
1.放疗通过内在线粒体凋亡途径诱导NPC细胞焦亡
在之前的研究中，作者发现辐射会引起NPC细胞出现焦亡的特征，如细胞膨大并出现细胞膜破裂，乳酸脱氢酶（LDH）释放量增多也证实了焦亡的发生（图1A-B）。接下来，作者展示了凋亡、焦亡及正常细胞的形态学变化过程，并以此为依据将辐射过后的NPC细胞分类，发现6中NPC细胞都发生了不同程度的焦亡（图1C-D）。同时，将NPC细胞中gasdermin家族的成员敲除后，发现GSDME的敲除会消除细胞的焦亡形态、LDH释放和细胞活性降低等现象，同时WB结果也观察到辐射后NPC细胞中cleaved-GSDME、cleaved-caspase3、cleaved-PAPR的表达量及从线粒体中释放的细胞色素c都显著上调（图1E-J）。以上结果表明放疗会通过内在线粒体凋亡途径导致GSDME依赖性的细胞焦亡。
2. 在体外GSDME上调促进NPC细胞焦亡及其放射敏感性
对辐射过后的NPC细胞进行细胞成像分析发现，死细胞中大部分是焦亡细胞（≥40%），且焦亡细胞/死细胞的比例及GSDME-N的表达量都与与细胞的存活率呈反比（图2A-B）。有趣的是，GSDME在大部分肿瘤细胞中都因启动子甲基化而沉默，但在NPC细胞中表达量却普遍较高（图2C）。接下来，作者分别在两种NPC细胞中将GSDME过表达或沉默。GSDME过表达后，细胞表现出更加明显的焦亡形态，且LDH释放量、GSDME-N表达量及焦亡细胞的比例都显著上调；而将GSDME沉默后则出相反的现象（图2D-K）。同时，GSMDE过表达也会增强NPC细胞的放射敏感性，而沉默后则刚好相反（图2L-M）。以上结果表明在体外GSDME上调会增强NPC细胞的焦亡和放射敏感性。
3. 在体内GSDME依赖性焦亡使NPC对放射敏感
为了在体内水平研究GSDME对NPC放射敏感性的影响，作者建立了异种移植模型（图3A）。在放疗后，GSDME过表达的小鼠其肿瘤的生长明显变慢，并表现出荧光强队、大小、重量及血清中的LDH含量降低，而GSDME敲除小鼠则表现出相反的现象（图3B-G）。肿瘤切片的HE染色结果表明GSDME过表达小鼠在放射处理后肿瘤的炎症坏死区域明显增多，WB结果也显示出其cleaved-GSDME表达量显著上调（图3H-I）。以上结果表明在体内GSDME通过介导焦亡增强NPC细胞的放射敏感性。
4.低GSDME表达量与NPC的放射耐受性和预后不良有关
接下来作者对10组冷冻切片和150组石蜡切片的NPC组织的GSDME含量进行了分析，其中放射耐受性的NPC组织相比于放射敏感性GSDME组织表现出显著的低GSDME表达量（图4A-B）。对免疫组化结果进行GSDME表达了评分，其中30%的患者表现出低GSDME表达量，并且放射耐受性组织其评分要显著低于放射敏感性组织（图4C-F）。同时，更低的GSDME表达量也与更差的PFS和LRPFS指数及预后不良有紧密关系（图4G-H）。
另外，高GSDME表达量患者其血清LDH含量在放疗后显著上升，且鼻咽喉镜及MR都显示出其癌症消退较快，而低GSDME表达量患者则表现出相反的趋势，表明放疗效果不佳（图4I-J）。以上结果表明在NPC组织中低GSDME表达量会导致放射耐受性和预后不良等结果。
5.OTUD4使GSDME去泛素化并稳定表达
泛素化-蛋白酶体蛋白降解途径在蛋白表达调控中发挥着重要的作用。有趣的是，通过免疫共沉淀分析发现与GSDME互作的蛋白主要是一种去泛素化酶OTUD4（图5A-B）。而在放射耐受性NPC细胞中OTUD4蛋白的表达量显著降低了（图5C），因此作者推测OTUD4使GSDME去泛素化并维持其稳定性。通过免疫共沉淀和截断实验也表明GSDME与OTUD4之间确实存在互作，并且是通过OUT结构域和GSDME-N结构域结合来完成的（图5D-G）。同时，OTUD4上调显著上调了GSDME的表达量，并增长了其半衰期，同时也抑制了GSDME的泛素化（图5I-K）。以上结果表明OTUD4引起NPC中GSMDE的去泛素化并维持其稳定。
6.OTUD4促进GSDME依赖性焦亡以增强NPC细胞的放射敏感性
将NPC细胞中的OTUD4过表达后，检测到其在放射处理后出现明显的焦亡形态，并且LDH释放量、焦亡细胞比例及死细胞比例都显著升高（图6A-E）。克隆形成实验也表明OTUD4过表达会增强NPC细胞的放射敏感性（图6F-G）。同时在体内实验中，OTUD4过表达会增强异体移植肿瘤对放射处理的敏感性，而GSDME沉默则能消除这种作用（图6H-L）。OTUD4过表达的小鼠在照射后也表现出更多的血清LDH含量和GSDME表达量（图6M-N）。以上结果表明OTUD4通过上调GSDME表达量来促进GSDME依赖性焦亡并增强NPC细胞的放射敏感性。
7.OTUD4/GSDME与NPC放疗反应的临床相关性
接下来作者对NPC组织中的OTUD4表达量进行分析，发现放射耐受性组织中OTUD4含量要低于放射敏感性组织，且OTUD4的低表达与较差的PFS指数显著相关（图7A-D）。更重要的是，在放疗后OTUD4低表达患者的GSDME水平较低、血清LDH含量无明显变化、肿瘤消退缓慢及预后不良，且OTUD4与GSDME表达呈正相关（图7E-H）。以上结果表明临床上OTUD4与GSDME表达呈正相关，低GSDME与NPC放射耐受性和预后不良有关。
conclusions
在本研究中，作者揭示了鼻咽癌患者产生放疗耐受性和预后不良的原因及其机制，将焦亡作为其主要成因进行研究。研究结果表明，放射治疗通过引起GSDME依赖性的细胞焦亡从而引起NPC细胞死亡，而去泛素化酶OTUD4通过使GSDME去泛素化并维持其稳定从而增强NPC的放射敏感性。在临床上，OTUD4与GSDME的表达成正比，低OTUD4表达与放疗耐受性和预后不良有显著关系。因此，靶向OTUD4/GSDME诱导的焦亡可能是一种提高鼻咽癌放疗效果的新策略。
转自：“学术查”微信公众号
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