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国自然热点:如何用蛋白质糖基化修饰研究肿瘤

2023/1/6 17:26:21  阅读:146 发布者:

研究背景:

蛋白质糖基化修饰是最重要、最普遍的蛋白质翻译后修饰之一, O-连接β-D-N-乙酰氨基葡萄糖 (O-GlcNAc) 是最常见的糖基化修饰,在O-GlcNAc转移酶(OGT)的催化下,O-GlcNAc基团连接至蛋白质的丝氨酸或苏氨酸羟基,可修饰细胞核、细胞质、细胞膜和线粒体中数千种蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基。O-GlcNAc 在多个水平上调节蛋白质功能,包括酶活性、能量代谢、细胞周期、转录活性、亚细胞定位、分子间相互作用和降解。蛋白O-GlcNAc化可通过调节蛋白稳定性、聚合或相互作用来控制关键信号传导和代谢途径。

SIRT7主要位于核仁中,与核糖体RNArRNA)基因结合,并参与有丝分裂期间的rDNA转录过程,其重要细胞功能是调节染色质重塑,催化组蛋白H3上赖氨酸18H3K18)的脱乙酰化。然而,肿瘤领域中O-GlcNAc化与SIRT7的相关研究很少。

研究成果:

今天给大家解读一篇发表在2022314日,浙江大学医学院附属第二医院吴育连团队在Cell Death DifferentiationIF=12.07)上发表题为O-GlcNAcylation and stablization of SIRT7 promote pancreatic cancer progression by blocking the SIRT7-REGγ interaction的文献,发现了O-GlcNAcylation通过抑制SIRT7蛋白与REGγ的相互作用以防止其降解来稳定SIRT7蛋白,并且胰腺癌细胞中SIRT7O-GlcNAcylation导致H3K18的低乙酰化,从而促进了几种肿瘤抑制基因的转录抑制以促进胰腺癌。

原文链接:https://www.nature.com/articles/s41418-022-00984-3

研究内容:

首先,56对胰腺肿瘤和正常邻近组织的代表性IHC染色显示肿瘤组织中SIRT7的表达高于匹配的肿瘤周围组织,更高的SIRT7表达水平与更高级的分化(P=0.015)和更高级的淋巴结转移(P=0.005)相关(1AB)Kaplan-Meier生存曲线显示, SIRT7表达水平较高患者的总生存期(OS)显著低于SIRT7表达较低的患者(P=0.0107)(图1C)。作者进一步检测了SIRT7在胰腺细胞系中的表达水平,发现SIRT 7在癌细胞(AsPC-1BxPC-3PANC-1MiaPaCa-2CFPAC-1)中的表达高于在正常导管上皮细胞(hTERT-HPNE)中的表达(图1D)。Western印迹确证敲低胰腺癌细胞PANC-1SIRT7sh1sh3序列对SIRT7敲低有效,分别命名为shSIRT 7-1shSIRT 7-2(图1E)。MTT 和集落形成实验显示SIRT 7敲除显著抑制PANC-1MiaPaCa-2细胞系中的细胞增殖(图1F-H)。裸鼠实验提示敲低PANC-1中的SIRT7后,移植瘤体积变小,总量减轻(图1 I-K)。这都说明SIRT7过表达与胰腺癌预后不良相关并促进胰腺癌细胞的体外和体内生长。

1SIRT7过表达与胰腺癌预后不良相关

然后,作者通过LC-MS/MS寻找与SIRT7相互作用的蛋白质,结果提示HEK293细胞中SIRT7OGT蛋白相互作用。外源性co-IP实验证实SIRT7HEK293T细胞中能与OGT相互作用,并被O-GlcNAc化。OGT908位赖氨酸被丙氨酸(K908A)取代的突变仍然可以与SIRT7相互作用。然而,该突变体未能诱导SIRT7 O-GlcNAc酰化,表明O-GlcNAc酰化SIRT7依赖于OGT的酶活性(图2B)。内源性Co-IP实验证实PANC-1MiaPaCa-2细胞中SIRT7OGT相互作用(图2 C)。IHC染色以及Duolink PLA显示PDAC患者标本中SIRT7OGT在细胞核中相互作用(图2 DE)。为了确定SIRT7OGT之间的相互作用结构域,作者制备了SIRT7蛋白的3个截短物,构建了4OGT截短体(图2 F-G)。Co-IP实验提示SIRT7的核心催化区域 (CC: 91-330)SIRT7N-末端 (C: 1-330) 不与OGT结合,全长和(N)可以与OGT结合。Co-IP实验提示∆OGT四肽重复序列 (TPR1-473) 导致OGT不能与SIRT7相互作用。

2OGT可使SIRT7发生O-GlcNAc

随后,Western Blot显示PANC-1MiaPaCa-2细胞中敲低OGT下调SIRT7的蛋白水平(图3A),但不影响SIRT7mRNA水平(图3B)。OGA抑制剂PugNAc thiamet-G (TMG)处理PANC-1MiaPaCa-2细胞可有效增强蛋白质O-GlcNAcylation,提高SIRT7的蛋白质水平(图3C)。过表达OGT显著促进了SIRT7的表达,而K908A突变体没有提高SIRT7的表达(图3D),OGT的过表达不改变SIRT7转录水平上的表达(图3E)。为了探索O-GlcNAc的改变是否可以改变SIRT 7的稳定性,作者用CHX处理PANC-1 NCsiOGT组以抑制蛋白质合成,Western Blot显示siOGT降低SIRT7的稳定性(图3F-G)。Western Blot显示CHX处理PANC-1NCK908A90 min后,SIRT7降至30%37%,而在WT组中70%

3:O-GlcNAcylation稳定SIRT7蛋白

接下来,泛素蛋白酶体途径介导的蛋白质降解是细胞调节胞内蛋白质水平和功能的常见机制。免疫共沉淀提示在PANC-1MiaPaCa-2细胞中过表达OGT使SIRT7泛素化水平降低而OGT-K908A激酶位点突变SIRT7泛素化水平不变,表明抑制作用依赖于酶活性(图4A)。siOGT处理PANC-1MiaPaCa-2细胞后SIRT7泛素化增强(图4 B)。构建泛素突变体,发现SIRT 7K63依赖性方式多泛素化(图4C),SIRT 7Ub-K48 R而不是Ub-K63 R多泛素化,OGT显著降低K48 R泛素化(图4D)。REGγ蛋白酶体作为一个新的泛素非依赖性途径的核心分子,通过与SIRT 7结合而介导SIRT 7的降解,作者进一步探讨OGT是否通过调节REGγ蛋白酶体途径而促进SIRT 7的稳定。过表达OGT降低了SIRT7REGγ相互作用(图4 E),PugNAc处理发现SIRT 7O-GlcNAc化越多,SIRT7REGγ的相互作用越少(图4F)。OGTREGγ依赖性方式增加SIRT 7的稳定性(图4G)。总之,O-GlcNAylated SIRT 7可能通过破坏SIRT 7REGγ之间的相互作用来增加SIRT 7的稳定性。

4: OGT通过防止SIRT7REGγ相互作用来提高其稳定性

其次,作者为了探索SIRT 7 O-GlcNAcylation是否会影响其在H3K18上的脱乙酰化。Western Blot显示敲低SIRT7后的PANC-1MiaPaCa-2细胞中H3K18Ac的表达水增加,H3H4等其他组蛋白乙酰化位点没有改变(图5A)。此外,OGT过表达而非K908 A引起的高-O-GlcNAc化降低了H3K18的乙酰化水平,而其他乙酰化位点没有变化(图5 B)。PANC-1MiaPaCa-2细胞中过表达OGT降低H3K18Ac,且可通过敲低SIRT7部分挽救。(图5C),这表明OGT通过SIRT 7促进H3K18的去乙酰化。qPCR显示沉默PANC-1细胞中的OGT导致SIRT7下游6个肿瘤抑制基因(NME1RPS20RPS7RPS14COPS2) 的表达上调(图5D),过表达PANC-1细胞中的OGT导致SIRT7下游靶基因在转录水平上的减少,且依赖其催化活性(图5E)。ChIP试验提示,siOGT介导SIRT 7 O-GlcNAcylation的缺失导致SIRT7下游靶基因启动子H3K18的高乙酰化和SIRT 7在下游靶基因启动子处的募集降低(图5 FG)。

5: 降低SIRT7 O-GlcNAcylation水平通过H3K18的高乙酰化促进靶基因的表达

再次,为了鉴定SIRT 7上的O-GlcNAc化位点,作者进行了蛋白纯化和质谱分析,通过LC-MS/MS揭示了SIRT 7上三个潜在的O-GlcNAc化位点(丝氨酸134S134)、136377)(图6A)。Co-IP实验结果显示,S136处的突变,而不是S134S377处的突变,导致O-GlcNAc信号的主要丢失,表明SIRT 7主要在S136O-GlcNAc化(图6 B)。此外, SIRT 7S136在多个物种中是保守的(图6C)。作者研究了SIRT 7S136O-GlcNAcylation的缺失是否影响蛋白质稳定性,在CHX处理后SIRT7-S136SIRT7 O-糖化的丧失降解最快,表明SIRT 7S136O-GlcNAc化可能促进SIRT 7的稳定性(图6D)。SIRT 7S136O-GlcNAcylation缺失可增加REGγ与SIRT 7的相互作用,也增加了H3K18的乙酰化,OGT的敲低消除了Flag-SIRT 7-WT的去乙酰化能力(图6 E-G)。S136 A有助于H3 K18高乙酰化和SIRT 7在靶基因的启动子处的较低募集(图6 H-J)。

6: SIRT7Ser136处发生O-GlcNAcylation

最后,MTT和集落形成实验以及裸鼠移植瘤实验显示,与表达SIRT 7的野生型组相比,其余3组(S136 A、野生型+shOGTS136 A +shOGT)显示较低的生长速率。此外,S136AWT+shOGTS136A+shOGT小鼠的Ki-67显著减少。这表明S136SIRT 7 O-GlcNAAcylation促进胰腺癌细胞的肿瘤进展。

7: S136上的SIRT 7 O-GlcNAc化促进胰腺癌的肿瘤进展

研究亮点:

1. SIRT 7在丝氨酸136残基(S136)处的O-GlcNAcylation是维持其蛋白质稳定性和H3K18的低乙酰化所必需的;

2. 阻断SIRT 7S136O-GlcNAcylation可减缓肿瘤进展;

3.O-GlcNAcylation是胰腺癌细胞中SIRT 7的一个重要翻译后修饰;

4.  揭示了通过靶向SIRT 7O-GlcNAcylation治疗胰腺癌的潜力。

转自:“学术查”微信公众号

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