国自思路：类器官模型的建立——国自然指南连年推荐的项目研究方向

类器官（Organoids）作为前沿热点技术之一，近年来备受关注。自2018年开始，类器官模型的建立，连续几年被国自然申报指南，列为推荐项目的研究方向，尤其强调在肿瘤研究新技术新方法方面，支持类器官模型的建立。类器官可作为多种疾病的体外模型，在干细胞与发育、再生医学、疾病研究、药物开发和肿瘤治疗等多个领域具有广泛的应用前景。

类器官模型是一种有良好潜力的临床前模型，可部分还原细胞在体内的组织和分子特性,与传统精准、再生医学手段相比，类器官能最大程度模拟体内器官，具有组织器官功能；类器官药物敏感性数据较全基因组测序更加准确；能与体外基因编辑技术结合，实现器官水平上的基因改造。

★文献推荐★

今天解读的文献是来自荷兰格罗宁根大学医学中心于发表在Stem Cell Reports ( IF 7.294)上题为“Generation and Differentiation of Adult Tissue-Derived Human ThyroidOrganoids”的文章，即成人组织源性人甲状腺器官的形成与分化。

★文献概述★

甲状腺功能减退症是由于甲状腺手术、外照射、发育不全或甲状腺自身免疫导致甲状腺激素缺乏所致。甲状腺激素对于大脑、骨骼肌和骨骼等多种组织的发育至关重要。越来越多的证据表明成年小鼠和人类甲状腺干细胞的存在。然而，尚未发现特定的甲状腺干细胞标记物。已经从许多组织中培养出类似组织的类器官和微型器官，例如肝脏、肠、唾液腺和子宫内膜。这些类器官包含组织特异性干细胞和分化细胞，并且类似于它们的来源器官。迄今为止，尚未开发出含有具有产生功能性卵泡潜力的成体干细胞的甲状腺衍生类器官。

作者的研究从小鼠和人类甲状腺组织中分离并表征了细胞，并开发了一种体外3D 培养系统，以允许培养具有潜在干细胞特征的细胞亚群的类似甲状腺的类器官。甲状腺功能减退的小鼠模型显示了这些类器官在肾被膜下方发育成甲状腺组织的能力。

甲状腺类器官体外 3D 培养系统

★研究内容★

1、甲状腺细胞的表征和自我更新能力

通过机械和酶促消化了三只小鼠的腺体，使分散的细胞在重新悬浮在甲状腺培养基中时形成球体（TGM；图 1A 和 1B）。同时也消化了健康的人类甲状腺组织，但将分散的细胞直接接种到基质胶中。在细胞外基质聚合后，添加了 Wnt 和 R-spondin1（TGM+ WR）的确定的人类 TGM，导致在 7 天内形成球体（图 1A 和 1B）。原代小鼠和人类甲状腺球的免疫标记显示 NKX2.1、甲状腺球蛋白和 T4 染色呈阳性，但降钙素未染色，从而进一步证实了它们的组织来源（图 1C）。通过在基质胶中重新接种分离的单个细胞并用培养基补充它们来评估单个甲状腺球衍生细胞的自我更新潜力（图 1D）。对于鼠类甲状腺类器官的形成，测试了TGM 和 TGM + WR两种类型的培养基，产生类似的自我更新潜力（图 1E 和 1F）。而人类类器官培养物还需要 Wnt 和 R-spondin1（图 1E 和1G）。虽然小鼠和人类培养物在分离后都显示出一些杂质（图 1B），可能由红细胞和成纤维细胞组成，但这些碎片在传代过程中消失了，只剩下甲状腺衍生细胞（图 1E）。NKX2.1 在鼠类和人甲状腺类器官中与 PAX8 共定位，而两种类器官培养物也表达产生甲状腺激素所需的碘化钠同向转运蛋白（NIS，也称为 SLC5A5）（图 1H），证实甲状腺表型和功能。大多数鼠类和人类类器官都表达 NKX2.1、PAX8 和 NIS（图 1I）。鼠类和人类类器官均表现出紧密连接标记 ZO-1 的表达，表明这些类器官能够维持和/或重建甲状腺上皮完整性（图 1H）。通过分析小鼠和人类甲状腺类器官的细胞周期状态，显示长期培养后鼠类器官的增殖潜力降低，而人类类器官保持其增殖能力。通过最初在前 24 小时内用 EdU 标记细胞，然后在另外 24 小时内用 BrdU 再次标记来进行双重标记。结合了 EdU 和 BrdU 的子细胞经历了随机分离，很可能不是干细胞。相比之下，BrdU 标记的细胞会经历非随机分离，并且可能是干细胞。流式细胞术分析表明 15.8% 的细胞为 BrdU 阳性（图 1J）。有趣的是，这与 TGM + WR 中第 3 代鼠甲状腺类器官的类器官形成效率一致（图 1E）。

2、甲状腺类器官的体外成熟和干性

通过执行微阵列在转录组水平上评估了原代组织来源细胞和早期（第 0-2 代）和后期（第 3-4 代）类器官的细胞特征。无监督层次聚类和主成分分析所示原代组织来源细胞全局基因表达明显不同于早期和后期传代的类器官（图 2A）。确定了一组基因在原代组织来源细胞和早期传代类器官之间以及早期和后期传代类器官之间的表达显著增加（图 2B），主要包括参与组蛋白结合和修饰（RBBP4、KDM5B、KDM4C）、存活（LY6E）、细胞粘附（钙粘蛋白、CDH3）和增殖（PCNA）的基因。虽然原代组织来源细胞与 POU5F1 和 REXO1 基因的早期或后期传代类器官之间没有差异，但检测到 SOX2 从早期到晚期类器官传代显著增加，FUT4 从原代组织来源细胞到早期类器官传代显著增加（图 2C）。

基因阵列分析表明，更多原始细胞在传代时表达的基因上调。与起源组织相比，甲状腺类器官的甲状腺分化评分 (TDS)显著降低，后期通道明显比早期通道未分化（图 2D）。在自我更新第 3-5 代后，在 Matrigel 中重新接种鼠类和人类类器官，并将它们与甲状腺成熟培养基一起孵育（图 2E）。7 天后形态学发生变化，鼠类和人类类器官都形成类似于甲状腺的结构（包含卵泡）（图 2F），以及类器官中分化标记的表达（图 2G）。此外，甲状腺标记物 NKX2.1有表达，小鼠中有 8 ± 0.3% 的区域是 T4 阳性，而对于人类人类中21±1.2% 的区域是 T4 阳性；小鼠和人类类器官均表现出 ZO-1 的表达，表明这些类器官在成熟时表现出极化并保持其上皮完整性（图 2H）。相比之下，在扩增培养基中培养的鼠或人类器官均不产生甲状腺球蛋白或 T4（图 2I）。这些结果表明，尽管发生去分化，类器官仍然能够分化为甲状腺的主要功能细胞类型，鼠源性和人类甲状腺源性细胞能够形成能够在体外自我更新和分化的类器官。

3、功能性甲状腺组织的体内生成

将分散的鼠和人甲状腺类器官移植到甲状腺功能减退的小鼠模型中。通过注射放射性碘 (131I)诱发甲状腺功能减退症，测量 131I 消融前后的游离 T4血清水平（图 3A）。131I 消融后五周，从肾囊下方的第 2 代移植了 600,000 个分散的鼠或人类器官细胞。八周后，小鼠甲状腺细胞形成表达 NKX2.1（56 ± 2.6%）、甲状腺球蛋白（35 ± 1.5% 面积）和 T4（10± 0.3% 面积）的滤泡结构。移植后 17 周，滤泡结构中NKX2.1 (75 ± 3.8%)、甲状腺球蛋白 (71 ± 4.9% 面积) 和 T4 (面积的 33 ±2.4%) 的大小和表达都大大增加（图 3B）。26 周后，人类甲状腺细胞形成表达 NKX2.1（76 ± 4.1%）、甲状腺球蛋白（面积的 20 ± 2.0%）和 T4（面积的24 ± 1.5%）的滤泡结构。尽管 NKX2.1 (71 ± 11.9%) 的表达在移植后 29 周保持稳定，但甲状腺球蛋白（面积的 86 ± 11.3%）和 T4（面积的 30 ± 9.5%）表达增加，表明新产生的甲状腺衍生结构的尺寸增加（图 3B）。此外，与假移植动物相比，注射了人源的类细胞的动物表现出更长的存活期（图 3C）。这些数据表明原代甲状腺细胞可以自我更新为类器官，并在体外和体内成熟为功能性甲状腺滤泡，产生游离 T4。

4、甲状腺类器官中缺乏甲状腺肿瘤标志物

与原代组织来源细胞相比，在甲状腺癌中被描述为上调的基因中有 72% 在早期传代类器官中下调，而其中一些基因在后期传代类器官中显示出进一步下调（图 4A）。在甲状腺癌中被下调的基因中有 71% 在早期传代类器官中显示出上调，其中大部分在后期传代类器官中保持上调或进一步增加（图 4B）。这些数据表明肿瘤相关标志物不会被长期培养诱导。用 1 Gy 的 X 射线照射鼠甲状腺类器官来源的细胞，将这些细胞培养到第 15 代，并用于皮下移植以测试致瘤潜力（图 4C）。使用人类滤泡甲状腺癌细胞系 (FTC-133) 作为阳性对照，皮下移植七周后，所有移植了 FTC-133 的对照小鼠（n = 6）都出现了肿瘤。

转自：“学术查”微信公众号

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