浙江大学梁岩课题发现抗坏血酸过氧化物酶APX1通过催化鲁米诺化学发光监测胞内活性氧迸发动态

活性氧（ROS）迸发植物抵御病原微生物侵染的重要免疫反应之一，ROS不仅可以直接杀死病原微生物，还可以作为信号分子诱导气孔关闭和系统获得抗性等其他免疫反应，因此解析植物体内ROS迸发的机制具有重要的意义。植物的免疫系统包括病原相关分子模式诱导的PTI，以及效应子诱导的ETI。通常PTI-ROS呈现迅速而短暂的动态，而ETI-ROS呈现缓慢而持久的动态。植物免疫中PTI-ROS迸发主要由质膜定位的呼吸爆发氧化酶RBOHD介导，诱导ROS在质外体产生，但ETI-ROS产生的时空动态还不是很清楚。

近日，浙江大学梁岩教授课题组在Plant Physiology在线发表了题为“Ascorbate peroxidase 1 allows monitoring of cytosolic accumulation of effector-triggered reactive oxygen species using a luminol-based assay”的研究论文，该研究发现胞质抗坏血酸过氧化物酶APX1具有催化鲁米诺氧化发光的能力，解释了为什么利用外源鲁米诺可以监测胞内ROS迸发的动态，通过此方法结合荧光染色法，该研究也提供了质外体ROS信号进入胞内的空间动力学证据。

梁岩团队前期研究发现，当利用鲁米诺化学发光法监测ROS，细菌脂多糖处理植物后，植物产生双相ROS迸发。因此本研究首先通过正向遗传学手段筛选了脂多糖处理后第二相持续型ROS迸发缺陷的突变体，并对其中一个突变体进行了图位克隆和全基因组测序，发现其胞质抗坏血酸过氧化物酶APX1基因突变。而APX1是已知清除胞内过量ROS的主要过氧化物酶，理论上其突变会导致胞内ROS积累，这与作者通过鲁米诺化学发光法检测的结论相矛盾，暗示了APX1可能是催化鲁米诺化学发光法所需要的酶。通过体外和体内的酶活检测，作者发现APX1除了以抗坏血酸作为经典底物行使清除ROS的功能外，还具有催化鲁米诺氧化发光的能力（图1），从而实现利用鲁米诺对胞内ROS迸发动态的监测。

图1. APX1催化鲁米诺氧化发光

另外，借助鲁米诺化学发光法，作者发现APX1也是效应子触发的ETI-ROS所必需的，暗示了ETI-ROS可能最终积累在胞内。利用比色、荧光法等其他ROS检测手段，作者最终揭示了无毒菌株处理植物后，ROS首先在质外体产生，6小时后会逐渐在胞内出现，最终在胞内积累增强（图2）。

图2. 效应子触发的活性氧在植物胞质内积累

综上所述，该研究利用APX1催化鲁米诺在胞质内氧化发光，揭示了ETI-ROS信号最终在胞质内积累，这为植物免疫中ROS信号的空间动力学提供了重要见解。

浙江大学农业与生物技术学院博士研究生洪秀芳为论文第一作者，梁岩教授为论文通讯作者。中国科学院分子植物科学卓越创新中心/植物生理生态研究所辛秀芳研究员和博士后袁民航也参与了该项工作。这项工作得到了国家自然科学基金和浙江省重点研发计划的支持。

论文链接：

https://doi.org/10.1093/plphys/kiac551

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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