内源性离子在G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)的功能和药理学中发挥重要作用，但原子证据有限。此外，与G蛋白亚型Gs、Gi/o和Gq/11相比，GPCRs对G12/13蛋白偶联机制的理解缺乏结构证据。孤儿受体GPR35主要在胃肠道中表达，与炎症性肠病(inflammatory bowel diseases，IBDs)密切相关，是研究离子调节和G13偶联的典型受体。
2022年12月21日，上海科技大学蒋轶研究员与中国科学院上海药物研究所徐华强研究员及蒋华良研究员合作在Cell Discovery 杂志在线发表题为“Insights into divalent cation regulation and G13-coupling of orphan receptor GPR35”的研究论文，该研究报道了G13偶联GPR35与抗过敏药物洛多沙胺结合的冷冻电子显微镜结构。该结构揭示了GPR35新颖的二价阳离子配位位点和独特的离子调控模式，并呈现出高正电荷结合袋和互补的静电配体识别模式，解释了GPR35结合酸性配体的杂乱性。
GPR35 - G13复合物与其他G蛋白亚型偶联的GPCRs的结构比较表明，Gα13亚基α5螺旋的C端向受体核心显著移动，而GPR35 TM6的细胞质端向外位移最小。一个典型的“蛋氨酸口袋”有助于GPR35的G13偶联。总之，这项发现为二价阳离子调制、配体识别以及随后GPR35的G13蛋白偶联提供了结构基础，并为设计GPR35靶向药物治疗IBDs提供了新的机会。
阳离子在生物系统中含量很高，在G蛋白偶联受体(GPCRs)的调控中起着重要作用。Na+可以稳定失活的构象状态，变构抑制GPCR的激活。Na+结合位点，用钠袋表示，已被证明是由许多GPCR结构所保守的。除了Na+外，其他阳离子也参与了GPCRs的变构调控。Ca2+通过结构接合激动剂和黑素皮质素受体MC1R6和MC4R7来增强配体活性。Mg2+还可促进激动剂与μ-类鸦片受体和催产素受体(oxytocin receptor，OTR)的结合，作为正变构调节剂。然而，不同二价阳离子的结合位点及其变构机制仍远未完全了解。
G蛋白异质三聚体，包括α， β和γ亚基，被激动剂结合的GPCRs识别和激活。哺乳动物中至少有18种不同的Gα亚基编码，可分为4个亚科，包括Gs、Gi/o、Gq/11和G12/13。在与激动剂结合的GPCRs偶联后，G12/13亚家族激活RAS超家族小G蛋白Rho A，调节许多生理功能，包括细胞生长、分化和肌动蛋白细胞骨架重组，并参与病理过程，如心血管疾病、代谢性疾病和癌症。与其他G蛋白亚型相比，工程化的G13偶联GPCR结构直到最近才被报道。GPCR-G12/13复杂结构的稀缺性限制了我们对GPCR-G12/13耦合的全面理解。GPR35是与G1318和Gi/o蛋白偶联的代表性GPCR，为探索G13募集的分子基础提供了机会。
GPR35属于A类GPCR， 20年前首次被发现，由于缺乏探索其生理学和药理学的药理学工具，其特征仍然很不明确。人类GPR35主要在胃肠道表达，主要在胃、小肠上皮细胞、树突状细胞和小肠和结肠的巨噬细胞中表达。它在调节胃肠道稳态中起着关键作用，并在代谢、免疫和肠道菌群系统之间提供了重要的联系。
GPR35信号不充分与炎症性肠病(IBDs)风险增加密切相关，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病，以及原发性硬化性胆管炎。一些编码变异，如GPR35中过度活跃的T108M突变，增加了IBDs8的风险。因此，GPR35作为IBD治疗的药物靶点引起了越来越多的兴趣。有趣的是，腹泻是IBDs最常见的症状，至少部分是由肠道电解质失衡引起的。这种不平衡是由吸收离子运输和分泌缺陷引起的，因此在GPR35、离子稳态和IBD发病机制之间建立了可能的联系。尽管已经取得了实质性进展，但广泛配体识别的结构基础尚不清楚，离子对GPR35活性调控和IBDs相关突变的认识仍有待阐明。
该研究确定了G13偶联GPR35与抗过敏药物洛多沙胺结合的冷冻电子显微镜(冷冻电镜)结构。在lodoxamide-GPR35-G13复合物的冷冻电镜结构中，研究人员观察到接近受体细胞外表面的强球形EM密度，与其他报道的A类GPCRs阳离子位点相比，位于一个独特的位置。通过测试二价阳离子Mg2+或Ca2+对GPR35的变构激动效应，进一步确定了该密度对它们的响应。在该研究的实验条件下使用的阳离子有效浓度是平均生理浓度的1 - 40倍。
图1. lodoxamide-GPR35-G13-scFv16配合物的整体结构（图源自Cell Discovery ）
然而，尽管不同体外试验的敏感性差异，但由于富含GPR35的肠道负责阳离子吸收，因此在局部肠道中较高的阳离子浓度是可以获得的。从进化的角度来看，对更高阳离子浓度的要求保证了GPR35在局部肠道中的精确调控。
此外，有报道称，IBDs可诱导上皮Na+-K+- ATP酶、Na+/H+交换体、上皮Na+通道和K+通道的功能缺陷和/或表达降低，通过降低Na+吸收和/或增加K+分泌来破坏水电解质稳态，最终导致腹泻，这是IBD最常见的症状。在该研究的实验条件下，GPR35似乎不受Na+或K+的影响。这些发现提示，二价阳离子Mg2+和Ca2+也可能通过调节GPR35而不是Na+和K+的平衡，以不同的方式参与IBD的发病机制，但仍有待鉴定。
图2. GPR35-G13耦合机制（图源自Cell Discovery ）
总的来说，这项工作确定了一个新的二价阳离子坐标位点和一个独特的变构激动模式，也为配体结合、受体激活和GPR35的G13偶联提供了见解，同时为互补静电配体识别模式为设计抗IBDs药物提供了线索。这些结构也为理解GPCRs特异性G13耦合的基本原理提供了一个框架。
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https://www.nature.com/articles/s41421-022-00499-8
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