如何制备 WB 实验的样品（内含技巧）？

每一个生物医学科研工作者都有一部 WB 实验血泪史，相信做 WB 的人都知道每个步骤都涉及到实验成败。

在此丁香实验针对不同样品性质，整理了 3 种制备 WB 实验样品的高效方法，助力小伙伴们科研不迷路！

以下所有内容都收录在「WB 实验专题」之中，大家也可以提前收藏订阅一波，内容更新不错过！

一、单层贴壁细胞总蛋白的提取

1. 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

2. 每瓶细胞加 3 ml 4℃ 预冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动 1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。

3. 按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）

4. 每瓶细胞加 400 μ 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5. 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮到培养瓶的一侧，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5 ml 离心管中。

6. 于 4℃ 下 12000 rpm 离心 5 min。（提前开离心机预冷）

7. 将离心后的上清分装转移倒 0.5 min 的离心管中放于-20℃ 保存。

二、组织中总蛋白的提取

1. 将少量组织块置于 1～2 ml 匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

2. 加 400 μ 单去污剂裂解液裂（含 PMSF）于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。

3. 几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。

4. 裂解 30 min 后，即可用移液器将裂解液移至 1.5 ml 离心管中，然后在 4℃ 下 12000rpm 离心 5 min，取上清分装于 0.5 ml 离心管中并置于 -20℃ 保存。

三、加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取

由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按（一）操作外还应收集培养液中的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：

1. 将培养液倒至 15 ml 离心管中，转速 2500 rpm，离心 5 min。

2. 弃上清，加入 4 ml PBS 并用枪轻轻吹打洗涤，然后 2500rpm 离心 5 min。弃上清后用 PBS 重复洗涤一次。

3. 用枪洗干上清后，加 100 μ 裂解液（含 PMSF）冰上裂解 30 min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。

4. 将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起，在 4℃条件下 12000rpm 离心 5 min，取上清分装于 0.5 ml 离心管中并置于-20℃ 保存。

转自：“丁香学术”微信公众号

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