编者按：认知功能障碍是指认知功能受到不同程度损害，表现为反应迟钝、记忆衰退、注意力缺陷等。认知功能障碍与大脑的氧气供应状态密切相关。缺氧环境直接影响大脑能量供应，影响脑内信息加工，进而诱发认知功能障碍。缺氧条件下，机体产生活性氮、活性氧等，影响大脑皮质和海马区功能，通过不同机制途径诱发认知功能障碍。研究缺氧导致认知功能障碍的机制是热门研究方向，在新靶点挖掘和新药物研发等方面具有广阔前景。下面这篇文献，以输送氧气和维持细胞功能的重要细胞——红细胞为切入点，研究红细胞氧气输送和供应，在认知和听觉功能障碍中的作用分子机制，发现了一种延缓老年认知和听觉衰退的新蛋白——红细胞抗衰老蛋白，值得关注，其研究思路亦值得借鉴。
缺氧与衰老和慢性疾病的发生关系密切
大脑缺氧造成大脑萎缩及认知功能障碍
氧化态的血红蛋白和还原态的血红蛋白(蓝色为氧气)
神经元比较活跃的脑区有大量氧化态的红细胞（功能性磁共振成像（fMRI））
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今天带来的思路来自德克萨斯大学麦戈文医学院生物化学和分子生物学系于2021年6月17日发表在PLOS Biology上题为“Erythrocyte adenosine A2B receptor prevents cognitive and auditorydysfunction by promoting hypoxic and metabolic reprogramming”的文章，即红细胞腺苷 A2B 受体通过促进缺氧和代谢重编程来预防认知和听觉功能障碍。
研究概述
缺氧会导致衰老并促进与年龄相关的认知和听力功能下降。尽管红细胞在氧 (O2) 运输中发挥作用，但它们在衰老和与年龄相关的认知能力下降和听力损失 (HL) 中的作用仍未确定。作者的研究表明，红细胞 ADOAR2B-BPGM 通过诱导 2,3-BPG 产生和触发 O2 输送来减缓与年龄相关的功能衰退的进展，作为“抗衰老”和“抗缺氧”恢复活力因子的关键作用。
分子机制图
研究思路
1、红细胞 ADORA2B 的基因消融导致早期认知和耳蜗功能下降
在对照和Adora2bf/f/EpoR-Cre+小鼠(eAdora2b-/-)中，对Adora2b基因进行红细胞特异性消融，通过评估学习、记忆（新物体识别[NOR]和巴恩斯迷宫测试[BM]）和听力（听觉脑干反应[ABR]）从而确定红细胞ADORA2B在衰老过程中（2个月与6个月）是否影响认知和耳蜗功能（图1A）。NOR分析显示，在6个月大时，eAdora2b-/-小鼠对研究新物体的兴趣较小（图1B）。BM评估与NOR分析类似，eAdora2b-/-和对照小鼠在2个月大时没有表现出差异，而在6个月大时，eAdora2b-/-小鼠在训练期间从第3天到第5天花费更多时间找到逃生箱，尤其是在第5天（图1C）。在评估短期记忆（图1D）和长期记忆（图1E）时，6个月大的eAdora2b-/-小鼠在2个月时的表现比对照组和eAdora2b-/-差。这些结果表明红细胞ADORA2B在认知功能中起着重要作用，包括空间和非空间学习和记忆能力。与2个月大的小鼠相比，6个月大的eAdora2b-/-和对照小鼠在阈值测试中表现出高频HL，尤其是在24KHz和32KHz时（图1F）。然而，在任一年龄的对照和eAdora2b-/-小鼠之间没有显著差异。ABR波代表刺激时的总电传输响应，从螺旋神经节神经元(SGN)和听觉神经(AN)（波I）到上行听觉通路（波II到V）。6个月大的对照组和eAdora2b-/-小鼠都表现出对一系列声音频率和强度的响应的波l幅度减小（图1G和1I）。然而，在6个月大时，eAdora2b-/-小鼠与其他3组相比，对不同频率和强度的反应显示出增加的波I潜伏期（图1H和1J），表明SGN和AN的电神经元转导受损。因此，ADORA2B的红细胞消融导致早期耳蜗功能衰退，其特征是SGN和AN的转导速度降低。
图1
2、红细胞ADORA2B的基因消融诱导免疫细胞的激活和炎症反应以及海马、皮层和耳蜗的缺氧适应受损
作者证明，红细胞ADORA2B的消融不会引起大脑皮层(CTX)和海马体(HIP)中神经元和星形胶质细胞死亡的明显变化。通过Iba1抗体染色评估了小胶质细胞数量和形态变化（图2A）。量化了CTX和HIP中小胶质细胞的密度（图2D），在6个月大的组中发现这些细胞的数量增加。与其他3组（图2B）相比，6个月大的eAdora2b-/-小鼠的小胶质细胞显示出较少的分枝形态，并且通过量化评估发现具有更大的细胞体尺寸（图2E），这被称为反应样形态。CD68（反应性小胶质细胞的标记）阳性小胶质细胞在2个月大的对照和eAdora2b-/-中都难以检测到，但在6个月大的对照中轻度升高，并在6个月大的eAdora2b-/-小鼠中进一步显著增加（图2C)。此外，通过与Iba1共染色的CD68对反应性小胶质细胞的量化也表明在6个月大的eAdora2b-/-小鼠中小胶质细胞活化增加（图2F）。作者在6个月对照组小鼠（对比两个月对照组）观察到一系列CTX和HIP中细胞因子mRNA的诱导，如白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)，而在6个月eAdora2b-/-小鼠（对比6个月对照组）观察到显著诱导（图2G）。这些发现表明，红细胞ADORA2B的消融有助于增加老年小鼠CTX和HIP中小胶质细胞的激活和炎症。与年龄匹配的对照相比，6个月大的eAdora2b-/-小鼠皮层中的HK、PK和LDH1和HIP中的HK显著减少。皮质中的HK表达水平受到红细胞ADORA2B消融的深刻影响（图2H）。这些发现表明，红细胞ADORA2B的缺失模拟了正常衰老的大脑，具有减弱的缺氧适应性反应和皮质和HIP中糖酵解酶的下调。
图2
Iba1阳性巨噬细胞在6个月大的两个实验组小鼠中显示出增大的细胞体大小，并与NF-200阳性区域呈现出可变的相互作用，这是指螺旋神经节细胞及其轴突逐渐聚集在一起形成AN（图3A-B)。Iba1阳性巨噬细胞密度的定量显示，与对照相比，6个月大的eAdora2b-/-小鼠的数量显著增加（图3C）。同时，与2个月大的小鼠相比，6个月大的对照小鼠的巨噬细胞数量也有所增加，这可能与C57BL/6背景下6个月大时发生的HL有关。通过分析耳蜗中细胞因子的表达水平发现（图3D），6个月大的对照（对比2个月大的对照）中编码IL-1β、IL-6、TNF-α和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA水平略有增加，在6个月大的eAdora2b-/-小鼠（与6个月大的对照组相比）中上升更加明显。这些数据表明，红细胞ADORA2B通过改善先天免疫细胞的激活和随后的炎症反应并维持大脑和耳蜗的缺氧适应性反应，对于防止认知和耳蜗功能衰退的早期发作至关重要。
图3
3、红细胞ADORA2B可防止缺氧条件下快速认知和耳蜗功能下降
将2个月大的对照和eAdora2b-/-小鼠暴露于缺氧下7天，并评估它们的认知、记忆和耳蜗功能。首先，通过评估他们在常氧下的基础NOR来修改NOR测试程序，然后是7天的缺氧挑战并再次测量他们的NOR以量化缺氧介导的认知功能变化（图4A）。结果发现缺氧治疗前2个月大的对照和eAdora2b-/-小鼠之间的NOR测试性能没有显著差异（图4B）。然而，在暴露于缺氧7天后，与eAdora2b-/-小鼠的NOR显著降低相比，对照小鼠对研究新物体的兴趣略有下降（图4B-C）。接下来，在连续5天内评估了小鼠在常氧下的基础学习曲线，然后是7天的缺氧挑战并测量他们的探测试验潜伏期，以量化缺氧介导的空间学习和记忆变化（图4D）。在缺氧治疗前的训练期间，从对照和eAdora2b-/-小鼠获得的学习曲线显示出相似的结果（图4E）。然而，在暴露于缺氧7天后，eAdora2b-/-小鼠比对照组花费更长的时间找到逃生箱，反映了记忆能力的缺陷（图4F）。
缺氧处理7天后，未观察到对照和突变小鼠之间频率阈值的显著差异（图4G）。分析ABR波形显示，在缺氧处理后，eAdora2b-/-小鼠和对照组之间在波I振幅上对于可变频率和强度没有显著差异（图4H，4J）。然而，eAdora2b-/-小鼠在响应一系列频率和声音强度时表现出比对照组更长的波I潜伏期（图4I，4K）。这些结果表明，需要红细胞ADORA2B来改善缺氧引起的SGC和AN传输速度的降低。缺氧会加速2个月大的eAdora2b-/-小鼠与衰老相关的学习、记忆和听力能力的下降。
图4
4、需要红细胞ADORA2B来减弱缺氧诱导的免疫细胞激活和大脑和耳蜗炎症反应的升高
在量化小胶质细胞后通过缺氧后脑中Iba1的IF染色评估了它们的激活（图5A-B）。在eAdora2b-/-小鼠中，在小胶质细胞的整个CTX和HIP中观察到更高密度的Iba1IF染色（图5E），而仅在HIP中观察到更大的细胞体大小（图5F），而在CTX中未观察到。同时，在eAdora2b-/-小鼠中，Iba1和CD68的双阳性染色显示出小胶质细胞激活的趋势（无显著性）（图5C，5G）。类似地，在缺氧处理后，eAdora2b-/-小鼠在NF200+神经元区域周围和耳蜗轴突周围出现更多巨噬细胞（图5D，5H）。因此，红细胞ADORA2B对于减轻缺氧诱导的大脑和耳蜗中免疫细胞的激活至关重要。qRT-PCR分析表明，在缺氧治疗后的eAdora2b-/-小鼠脑CTX中，IL-6和TNF-αmRNA水平显著增加；而在HIP和耳蜗中，IL-1β和IL-6 mRNA表达显著升高，TNF-αmRNA的表达也高于缺氧条件下的对照组，但没有达到显著水平。在3个区域（CTX、HIP和耳蜗）中，iNOS mRNA水平在缺氧条件后，对照和eAdora2b-/-小鼠之间几乎没有差异，表明该基因不受缺氧条件下红细胞ADORA2B基因消融的影响（图5I-J）。总而言之，红细胞ADORA2B在减弱缺氧诱导的免疫反应以及认知和耳蜗功能下降方面发挥了以前未被认识到的有益作用。
图5
5、红细胞ADORA2B介导的BPG变位酶激活和2,3-BPG产生的诱导是防止衰老和缺氧引起的认知和耳蜗功能衰退的常见补偿机制
无监督的高通量代谢组学确定了2个月大的对照和eAdora2b-/-中分离的红细胞在常氧条件下和缺氧处理7天后的代谢变化（图6A）。PCA分析发现缺氧后eAdora2b-/-和对照小鼠之间出现显著的代谢变化（图6B）。代谢途径影响评分分析表明，低氧条件下eAdora2b-/-小鼠的糖酵解受到显著影响（图6C）。红细胞ADORA2B介导的AMPK-BPGM激活促进3-磷酸甘油醛(G3P)代谢生成2,3-BPG，从而导致HGB释放O2以抵消缺氧（图6E）。在所有检测到的糖酵解代谢物中，对照小鼠在缺氧条件下诱导红细胞2,3-BPG水平，而在eAdora2b-/-小鼠中其诱导显著减弱（图6D）。G3P在低氧条件下在对照中显著降低，而在eAdora2b-/-小鼠中其降低显著减弱（图6F）。与此同时，与eAdora2b-/-小鼠相比，对照小鼠在缺氧条件下的2,3-BPG/G3P比率在一定范围内增加（图6G），这意味着红细胞ADORA2B激活是缺氧诱导的糖酵解和通过AMPK-BPGM信号级联增加2,3-BPG的产生必不可少。
AMPK活性在来自对照或突变体的不同年龄组之间没有显示出显著著差异。然而，AMPK活性在2个月大的对照小鼠中被显著诱导，但在eAdora2b-/-小鼠中没有被缺氧诱导（图6H）。这些结果表明，ADORA2B介导的AMPK激活是一种补偿机制，可以抵消缺氧引起的认知和听力功能下降，但在常氧下不会正常衰老。在常氧条件下，6个月大的eAdora2b-/-小鼠的BPG变位酶活性和2,3-BPG浓度显著降低，并且在2个月大的eAdora2b-/-小鼠中，它们对缺氧的诱导减弱（图6I-J）。这些结果表明，红细胞ADORA2B介导的BPG变位酶激活是红细胞缺氧代谢重编程向糖酵解的基础，以诱导2,3-BPG产生，以防止缺氧和衰老介导的认知和听力功能下降。
转自：“学术查”微信公众号
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