雄激素性脱发（AGA）是由不规则的头发生长周期引起的最常见的脱发类型。人真皮毛乳头细胞（DPCs）中的5-α-还原酶产生的二氢睾酮（DHT）过度活跃被认为是AGA的主要诱因。DHT可以与雄激素受体（AR）结合引起DPCs的衰老，并引起这些衰老细胞的毛发生长抑制因子表达上调，如DKK-1、IL-6、TGF-β，从而抑制毛囊干细胞的毛囊新生、分化和生长，阻断毛发从休止期到生长期的过渡，最终诱导脱发。因此，减少由DHT诱导的DPCs衰老对于预防AGA至关重要。
研究背景
线粒体相关内质网膜（MAM）增多时会出现线粒体的功能障碍，这种接触会通过调控两种结构之间的钙转运影响细胞代谢。据报道，1,4,5-三磷酸肌醇受体（IP3R）与电压依赖性阴离子选择通道蛋白（VDAC）结合增多会引起线粒体内钙过量，引起线粒体膜电位的降低及mtROS的升高，最终导致线粒体功能障碍。
线粒体功能障碍是诱导暴露于高DHT浓度的细胞衰老的关键因素。尽管DPC的早衰与线粒体ROS水平过高紧密相关，但MAM形成是否参与DPCs衰老过程尚不清楚。此外，由IP3R-VDAC1介导的MAM依赖性线粒体钙积累是细胞衰老和衰老的关键因素。因此研究诱导MAM依赖性线粒体钙积累的机制，是治疗由DHT介导的DPCs衰老和雄激素性脱发的关键。
研究成果
2022年3月8日，首尔国立大学何在韩及其团队在Journal of biomedical science（IF=12.771）杂志上发表了题为“Cyanidin 3-O-arabinoside suppresses DHT-induced dermal papilla cell senescence by modulating p38-dependent ER-mitochondria contacts”的文章。在该研究中，作者探讨了花青素3-O-阿拉伯糖苷（C3A）对DHT介导的DPC衰老的影响，以及线粒体钙稳态调控的详细机制，并确定了C3A对AGA小鼠模型中DPCs衰老介导的脱发的保护作用。作者的研究确定了C3A对p38介导的MAM形成和线粒体钙内流的影响，从而减轻了DHT诱导的DPC衰老，为雄激素性脱发提供了可能的候选药物。
DOI: 10.1186/s12929-022-00800-7
研究过程与结果
1.C3A对DHT引起的DPCs衰老的影响
DHT处理后，β-半乳糖苷酶阳性的DPCs比例浓度依赖性地增多，并且mtROS水平也上升了，这说明DPCs在DHT的作用下发生了衰老（图1A-C）。随后，作者评估了多种花青素候选药物对DHT引起DPCs衰老的影响，结果表明C3A对mtROS水平的降低程度要优于C3-葡萄糖苷和C3-半乳糖苷（图1D）。同时，C3A处理也能降低DHT处理后DPCs中β-半乳糖苷酶阳性的细胞比例，并下调衰老因子p21和p16的表达（图1E-F）。基于DPCs衰老会改变多种促进毛囊干细胞（HFSCs）增殖的生长因子的分泌，作者对相关生长因子进行了检测，结果表明FGF6和FGF4的表达均下调（图1G）。另外，用DHT处理过的DPCs的条件培养基处理正常HFSCs会抑制其增殖，而C3A预处理DPCs后则会降低这种对HFSCs有害影响，并下调条件培养基中促毛囊退化因子（DKK-1、IL-6、TGF-β1）的含量和HFSCs中衰老因子的表达（图1H-K）。以上结果表明C3A能有效减缓DHT引起的DPCs衰老和相关因子的分泌，并促进HFSCs的增殖。
图1.C3A对DHT诱导的DPCs衰老的影响
2.C3A对DHT诱导的AR核易位的影响
雄激素受体（AR）与雄激素结合后会引起AR的核易位，并诱导AR表达并作为雄激素响应基因的转录因子。DHT处理后，DPCs中AR的mRNA和蛋白表达水平及AR的核易位水平都显著上调，而C3A预处理后则能够抑制这一现象（图2A-D）。通过荧光素酶报告基因实验也检测出DHT处理后DPCs中AR转录水平上升，而C3A处理能使其转录水平降低至接近对照组（图2E）。与DHT结合的AR能和热休克蛋白（HSP27）互作，从而转移至核中。作者发现DHT处理能促进HSP27的磷酸化，而C3A预处理则能降低其磷酸化水平（图2F-G）。以上结果表明C3A通过调节HSP27的磷酸化在抑制DHT诱导的AR核易位中起关键作用。
图2.C3A对DHT诱导的AR核易位的影响
3.C3A对DHT诱导的p38磷酸化的影响
据报道，质膜上的AR（mAR）能激活NADPH氧化酶（NOX）并产生ROS，从而激活MAPK信号通路。加拿大麻素是一种NOX复合物抑制剂，能降低由DHT诱导的ROS产生、p38磷酸化及DPCs磷酸化，而C3A处理也能起到相同的结果（图3A-E）。使用p38抑制剂SB203580处理，能够降低DHT诱导的HSP27磷酸化并有效抑制DHT引起的DPCs衰老（图3F-H）。另外，BSA偶联的DHT对mAR的激活作用要强于细胞内的AR，用BSA-DHT处理能诱导ROS产生和p38磷酸化，而加拿大麻素和C3A则能够抑制这一现象（图3I-K）。以上结果表明C3A通过调控NOX依赖性的ROS产生抑制p38介导的HSP27磷酸化。
图3.C3A对DHT诱导的p38磷酸化的影响
4.C3A对DHT诱导的内质网-线粒体接触的影响
线粒体相关内质网膜（MAM）会促进线粒体和ER之间的交流，并在钙转运到线粒体中和衰老过程中发挥作用。DHT处理能够增加DPCs中ER标记物和线粒体标记物的共定位，而C3A处理能消除这一现象（图4A）。接下来，作者检测发现，C3A能够抑制由DHT引起的线粒体钙流调控因子VDAC1的mRNA表达水平上调，而其他因子表达量则无明显变化（图4B-C）。通过邻位连接实验检测发现，C3A能够抑制由DHT引起的VDAC1和IR3P1的互作增多(图4D)。另外，在线粒体的钙蓄积被抑制后，β-半乳糖糖苷酶阳性的细胞数量和衰老因子p16和p21的表达量都显著下调（图4E-F）。以上结果表明C3A通过下调VDAC1表达和通过抑制VDAC1和IP3R1互作介导的ER-线粒体接触延缓DPCs的衰老。
图4. C3A对DHT诱导的ER-线粒体接触的影响
5.C3A对DHT诱导的线粒体钙蓄积的影响
线粒体钙蓄积会导致线粒体功能障碍并引起细胞衰老。通过Rhod-2染色发现，C3A能够抑制由DHT引起的DPCs线粒体钙流，而p38的抑制也能降低由DHT引起的VDAC1表达和线粒体钙流（图5A-C）。将VDAC1沉默后，会抑制由DHT引起的Rhod-2和β-半乳糖糖苷酶阳性细胞比例上升及p21和p16表达上调（图5D-F）。以上结果表明C3A通过调控p38介导的VDAC1表达来抑制DHT诱导的线粒体钙蓄积。
图5. C3A对DHT诱导的线粒体钙蓄积的影响
6.C3A对AGA小鼠模型毛发生长周期的影响
DHT诱导的DPCs衰老与毛发生长减缓和毛囊干细胞的改变有关，因此作者通过构建DHT诱导的小鼠脱发模型来研究C3A对毛发生长的影响（图6A）。通过肉眼观察，发现C3A、加拿大麻素和SB203580都能缓解由DHT引起的毛发生长变慢（图6B）。HE染色观察结果显示DHT处理虽然没有减少毛囊的数量，但其使毛囊的大小减小了，而C3A、加拿大麻素和SB203580能够抑制这一现象（图6B-E）。同时，C3A也能缓解由DHT引起的皮肤变薄及毛囊中Ki67表达量下调（图6F-H），说明C3A能引起毛发的生长周期由休止期进入到生长期。以上结果表明C3A通过p38和NOX依赖性的方法抑制DPCs衰老并缓解由DHT引起的毛发生长周期延迟和毛发生长变慢。
图6. C3A对AGA小鼠模型中毛发生长周期的影响
总结
在本研究中，作者研究了一种花青素衍生物花青素3-O-阿拉伯糖苷对由DHT引起的DPCs衰老及毛发生长变慢的影响。结果表明，C3A通过p38和NOX依赖性的方式抑制由DHT引起的ROS产生及核易位，从而抑制VDAC1和IR3P1互作以减少线粒体与内质网的接触从而降低线粒体的钙蓄积，最终缓解DPCs的衰老和雄脱小鼠毛发生长变慢。
此研究开发了一种潜在的雄激素性脱发治疗药物，并对其作用机制进行了深入探究，对脱发或DPCs衰老的治疗具有重要的意义。
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