WB 是用于从蛋白质混合物中检测特定蛋白质分子的实验方法。混合物可以包括与特定组织或细胞类型相关的所有蛋白质。WB 不仅可用于检测特定蛋白质的存在与否，还可以确定特定蛋白质在系统中是否被上调或下调，检测翻译后修饰，相对于标准量化蛋白质水平，检测特定蛋白质在细胞中的定位。
WB 如何做才能确保得到的结果有意义呢？其中很重要的一点就是样本如何上样。是等蛋白量上样还是等体积上样更为严谨呢？我们一起看案例找到答案吧！
等蛋白质量 VS 等样品体积，谁更胜一筹？
例如：想检测同细胞株在不同处理条件下目标蛋白的表达差异，用总蛋白进行 WB 检测时，等蛋白质量上样和等样品体积上样哪个更准确呢？
等体积上样：通常是使用相同量的细胞或组织样品，加相同量的裂解液裂解样品，弃掉不可溶组分，吸取上清作为蛋白样品，再取等体积蛋白样品进行上样。
这样做会存在两个误差：
1
细胞计数同时铺板，因细胞贴壁存在差异或生长存在差异，故不同细胞盘里的细胞数量不一定一样多，所以这时等细胞量已经不成立。
2
蛋白样品提取的过程中，由于使用 RIPA 裂解液通常会产生一部分 RIPA 不可溶性组分沉淀，不同样品间产生的不可溶组分的量有所不同，加之吸取上清液时的操作也会产生偏差，故无法获取完全一致体积的蛋白样品。
等质量上样：提取蛋白样品后，先进行蛋白浓度测定，通过稀释等方法将各样品浓度调成一致，再取相同体积样品上样，即为等质量上样。
两种方法相比较，等质量上样，可理解为在同等质量的蛋白质中，比较目标蛋白量的占比差异。而等体积上样，只是在看似相同而实为有较大差异的条件下检测，所得的结果会产生较大误差。故使用等质量上样检测目标蛋白的表达差异更为准确，结果具有比较意义。
如何做到亚细胞组分上样精准？
在不同的细胞组分中检测特定蛋白分布差异或追踪蛋白转运研究时，细胞组分分离之后，由于需要使用各组分内参分别检测组分分离情况，而没有统一的内参校准上样量，又该如何上样比较准确呢？
案例一：在细胞样品胞质胞核分离完成后，作者使用 Lamin B 和 GAPDH 分别作为胞核和胞浆组分的内参（如下图），验证分离的胞质组分和胞核组分无交叉污染（Cat#SC-003 Invent 胞质胞核分离试剂盒分离）。在细胞核和细胞质分离提取过程中，由于两组分中蛋白量存在较大差异，故会添加不同量的裂解液进行提取，并非是将样品一分为二，如使用等体积上样的方法对比目标蛋白表达量差异，则会产生根本上的误差。如使用等蛋白量的胞质和胞核样品上样，再加入等蛋白量的总蛋白作对照上样，用胞质内参和胞核内参同时检测三个样品，则可以验证在同等蛋白量中，目标蛋白在不同组分中的表达差异，且同时可以与总蛋白中目标蛋白量的差异进行比较，这是最严谨的。
来源 FASEB J
案例说明：
TGF-β/Smads 信号通路可以被 Nur77 显著抑制，表明 Nur77 控制 TGF-β/Smads 信号转导中关键步骤的激活。同时 Nur77 与 Smad7（Smad2/3 核易位的主要抑制因子）相互作用，稳定了 Smad7 蛋白稳态。当 Nur77 缺乏导致 Smad7 降解，加重 Smad2/3 磷酸化。为验证上述猜想研究人员设计 shNur77 干扰细胞 Nur77 表达，同时正常细胞做对照，而后分离胞质胞核，WB 检测 Smad2/3 以及 p-Smad2/3 在胞质胞核两组分的变化。可以看到胞质内参 GAPDH 只在胞质组分检出，胞核内参 LaminB 只在胞核组分检出，说明胞质胞核组分分离干净，目的蛋白 Smad2/3 在 shNur77 干扰前后胞质组分中没有变化，但是干扰后胞核内 Smad2/3 量变多，证实了前面的猜想。同时干扰后胞质胞核中的 Smad2/3 磷酸化增加这也与猜想一致。等质量上样作为基准，组分间蛋白进行比较，分析结果才有意义。
案例二：研究蛋白转运或蛋白定位时，为了验证蛋白在不同的亚细胞组分中表达情况，通常会将细胞先进行亚细胞组分分离，细胞分成细胞质膜，细胞器，总膜，细胞浆，又或者是分离线粒体，溶酶体，内质网，高尔基体，也需如上所述，按照等蛋白量上样，同时选用各组分对应的内参同时检测不同组分。
来源：FASEB J
案例说明：
为了验证 LPAR 信号传导是否调节激动剂诱导的 rac1 易位至 PMVEC 中的质膜。使用 Cat#SM-005 Invent 质膜及组分分离试剂盒将 PMVEC 细胞进行亚细胞分离，分离的总膜，细胞器膜，质膜部分进行 WB 检测。
A）用各细胞器内参蛋白检测分离得到的 PM，质膜；TM，总膜；OM，细胞器膜。显示质膜内参蛋白 Na+ /K+ -ATPase 和 flotillin1 在质膜部分富集，线粒体内参蛋白 cox IV，高尔基体内参蛋白 RCAS1 和 ER 内参蛋白 Sec6a1 在质膜组分中几乎不存在，质膜内参和细胞器各内参在总膜组分均检出，各细胞器内参在细胞器膜组分检出而质膜内参在此不存在，证明质膜与细胞器完美分开为后续质膜组分检测目标蛋白 RAC1 变化提供支点。
B）细胞在没有或有 Ki16425 的情况下进行预培养，然后用 PMA 或 Ang II 刺激 1 小时。分离质膜部分并通过蛋白质印迹分析 rac1 和 flotillin 作为上样对照。用 NOX2 激动剂（Ang II，PMA）处理 PMVEC 细胞导致质膜部分中 rac1 的表达增加；用 LPAR 抑制剂 Ki16425 处理细胞可以逆转增加的表达。由上可以得出 LPA 对 PMVEC 中 NOX2 激活的影响位点位于 rac 激活的上游，并且 LPAR 的激活是 rac 易位所必需的。同样各组分各样本都需要等蛋白量上样，得出的结果才具有比较意义。
小结
WB 实验中，无论是使用总蛋白在样本间比较蛋白表达量差异，还是使用亚细胞组分比较组分间蛋白的表达量差异，比较都应在等蛋白量上样的基础上进行才足够严谨，等蛋白量上样是 WB 结果比较的基础。
转自：“丁香学术”微信公众号
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