可编程的基因编辑工具已经改变了生命科学，并显示出治疗遗传疾病的潜力。在目前可以在哺乳动物细胞中进行靶向DNA改变的CRISPR-Cas技术中，先导编辑器提供了一种不同寻常的多功能、特异性和精确性的结合。先导编辑器不需要双链DNA断裂，几乎可以在活细胞的DNA中进行任何替换、小插入和小删除。先导编辑最低限度地需要一个可编程的切口酶融合到聚合酶，和一个扩展的引导RNA，既指定目标位点，又模板所需的基因组编辑。
2022年11月7日，哈佛大学和博德研究所的刘如谦 (David R. Liu) 团队在Nature Reviews Genetics 杂志在线发表题为“Prime editing for precise and highly versatile genome manipulation”的综述，这篇综述总结了生成可设计的基因组变化的先导编辑策略，强调了它们的局限性和绕开这些瓶颈的最新进展，并讨论了应用和未来的方向。
能够改变活细胞DNA特定位点序列的技术已经彻底改变了生物医学科学，推动了生物技术的创新，并在基因疾病的治疗纠正方面显示出临床前景。理想的基因编辑技术可以将任何目标DNA转化为任何其他选择的序列，产量高，在目标位点上的不希望的副产物最少，在非目标基因组位点上的意外变化最少。因此，开发高效、多用途、产品纯度和序列特异性的基因编辑工具一直是生命科学的长期目标。
RNA可编程CRISPR系统的里程碑式发现导致了三类技术的诞生，它们可以在广泛的靶位点和各种细胞类型和生物体中编辑哺乳动物细胞的基因组:CRISPR相关(CRISPR-associated, Cas)核酸酶、碱基编辑器和先导编辑器。这些技术在能力和限制上有很大的不同，这决定了它们在精确基因组操作方面的最佳使用。
Cas9或Cas12等Cas核酸酶通过在引导RNA (guide RNA, gRNA)指定的目标序列上进行双链DNA断裂(double-strand DNA break, DSB)来刺激目标DNA修饰。由于核酸酶本身不具有直接改变DNA序列的能力，细胞通路，如非同源端连接(non-homologous end joining, NHEJ)或微同源端连接(microhomology-mediated end joining, MMEJ)，可以修复这种DSB中间体，产生插入和删除(indel)的混合结果。这些不确定的结果大部分导致编码序列靶点的框架转换，所以Cas核酸酶非常适合基因破坏。然而，尽管这些indel可以偶尔与期望的编辑结果相一致，但indel的顺序不能由研究者指定或精确控制。
为了进行特定的DNA改变，核酸酶可以与外源性供体DNA模板共传递，该模板包含所需的编辑，两侧是与基因组靶位点同源的序列。DSB生成后，细胞同源定向修复(homology-directed repair, HDR)可以将DNA模板重组到DSB位点。虽然这种方法原则上几乎可以进行任何类型的编辑(例如，点突变、插入或删除)，但HDR主要在有丝分裂细胞中活动，通常在处理DSBs时被末端连接所击败。这些因素导致频繁的indel副产物，损害了精确校正的编辑结果的纯度。
在一种称为同源无关的靶向整合(homology-independent targeted integration, HITI)的方法中，缺乏同源序列的DNA供体可以通过NHEJ插入到DSB位点，但插入的方向和数量无法控制，不希望得到的结果通常超过精确的预期编辑。此外，核酸酶产生的DSB可引起大量缺失、染色体易位、染色体突变、逆转录转座子插入和p53激活，可富集致癌细胞。总之，使用核酸酶进行精确编辑的挑战和不良后果启发了其他技术的发展，这些技术可以在不创建DSB的情况下介导精确的基因校正。
碱基编辑就是这样一种技术。碱基编辑器可以产生C•G-to-T•A, A•T-to-G•C，在某些情况下，无需直接产生DSB或需要DNA供体，就可以产生C•G-to-G•C点突变。碱基编辑器由一个可编程的DNA结合蛋白组成，如催化受损的Cas核酸酶或转录激活物样效应器(transcription activator-like effector, TALE)重复数组融合到脱氨酶上，将一个碱基转化为另一个碱基。对于CRISPR碱基编辑器，引导RNA以碱基编辑器为目标，在基因组DNA中结合匹配的序列。碱基编辑器的Cas蛋白结构域置换目标位点的单链DNA (single-stranded DNA, ssDNA)，触发的ssDNA特异性脱氨酶的脱氨作用。
胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editors, CBEs)和腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editors, ABEs)分别含有催化C•G-to-T•A和A•T-to-G•C变化的脱氨酶。C•G-to-G•C碱基编辑器(C•G-to-G•C base editors, CGBEs)与CBEs相似，但刺激脱氨基胞嘧啶碱基被鸟嘌呤取代，尽管与CBEs和ABEs相比，其典型效率和产品纯度较低。与Cas核酸酶相比，碱基编辑器在很少有不良副产物的情况下表现出更高的效率，并且在并排比较中显示出DSB比核酸酶少得多的不良结果。
由于碱基编辑器通常在4-5个核苷酸(nt)的小窗口内脱胺，非常接近目标C或A的C或A核苷酸也可以进行转换，导致“bystander editing”。然而，在某些情况下，邻近核苷酸的非期望碱基编辑可能难以避免。碱基编辑活动也受到Cas结构域的靶向范围的限制，这需要在距离目标核苷酸的特定距离范围(通常为15±2 nt)存在一个原间隔相邻基序(PAM)序列。此外，一些碱基编辑器可以诱导DNA和RNA的脱靶突变。尽管工程上的努力已经减轻了其中的许多缺点，但目前的碱基编辑器只能实现12种可能类型的点突变中的6种，这使得许多其他类型的DNA编辑，如插入、删除和大多数倒置，超出了碱基编辑的能力。
图1. 哺乳动物细胞的精确基因组编辑（图源自Nature Reviews Genetics ）
在这篇综述中，刘如谦团队描述了先导编辑的功能和限制，强调了其性能和范围的改进，并讨论了进一步增强的应用和机会。以精确和可编程的方式操纵基因组的能力已经改变了生命科学。与其他基因编辑技术相比，先导编辑提供了更大的通用性、产品纯度和目标序列特异性。启动编辑的潜力推动了许多创新研究，以提高其效率，扩展其能力，并证明其在基础研究和治疗中的应用。
图1. 先导编辑系统的进展（图源自Nature Reviews Genetics ）
总的来说，先导编辑的几个剩余挑战为进一步发展提供了机会。在没有重组酶的帮助下，目前的先导编辑器通常很难有效地插入或替换超过100 nt的DNA。尽管超过90%的已知致病性突变小于30 bp，但延长可能的序列插入长度或用先导编辑重新编码可能使基因大小的整合不需要供体DNA或重组酶。
研究其他类型的先导编辑的细胞决定因素，如插入、删除和双pegRNA方法，可以揭示可以进一步增强的途径。提高丝氨酸重组酶的催化活性或DNA靶结合也可以提高与twinPE或类似系统的大负载集成效率。最后，PEs进入目标细胞类型和组织仍然是体内初始编辑的主要限制。对于实现主要编辑在疾病建模和治疗纠正方面的全部潜力，改善递送无疑至关重要。
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https://www.nature.com/articles/s41576-022-00541-1
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