背根神经节中单细胞质量细胞术测定的体感觉多样化和成熟的发育图谱

背景

位于背根神经节 (DRG)的体感神经元向中枢神经系统 (CNS)传递多种感觉刺激，包括机械压力、肢体位置变化、温度、疼痛和瘙痒。既往的研究发现，在小鼠发育第一个月时，外周神经系统 (PNS)中有多达13个成熟感觉神经元亚群，成年后有多达18个亚群。虽然体感神经元在成熟时的特征已经相当明确，但许多有关其发育的基本问题仍未解决。特别是，DRG中间祖细胞类型的特征仍不明确，并且控制细胞类型的分子谱还没有被定义。识别控制DRG发育的分子轨迹和细胞命运决定有望改善对具有发育成分的感觉障碍的理解，如先天性痛觉不敏感合并无汗症 (CIPA)和自闭症谱系障碍 (ASD)。

简介

2022年10月27日，来自美国弗吉尼亚大学的Eli R. Zunder及其团队在Nat Neurosci (IF: 20.071)杂志上发表了名为A developmental atlas of somatosensory diversification and maturation in the dorsal root ganglia by single-cell mass cytometry的研究[1]。

研究要点

精确控制体感系统的发育对于检测疼痛、瘙痒、温度、机械触摸和体位至关重要。为了研究在体感发育过程中发生的蛋白水平变化，我们对C57/BL6雌雄小鼠的背根神经节进行了单细胞质量细胞计数，从胚胎第11.5天到出生后第4天，每天收集一次产仔复制品。通过测量近300万个细胞，我们在所有时间点定量了30种分子水平不同的体感胶质细胞和41种不同的神经元状态。分化轨迹分析显示，罕见细胞共表达两种或多种Trk受体，并过度表达干细胞标志物，表明这些神经营养因子受体在细胞命运特异性中发挥作用。与之前基于RNA的研究相比，发现许多蛋白质mRNA对之间存在显著差异，证明了蛋白质水平测量对识别功能性细胞状态的重要性。总体而言，本研究表明，质谱细胞术是一种高通量、可扩展的平台，可快速对体感组织进行表型分析。

主要结果

通过蛋白表达对DRG细胞类型的识别

为了通过它们的蛋白表达特征来识别和表征DRG中的细胞类型，我们首先采用了质谱细胞分析方法来检测神经组织。这涉及到优化组织解剖和细胞分离技术，并开发针对特定神经元和胶质亚型的41-抗体染色组合。每种抗体与一种独特的稀土金属同位素偶联，然后使用已知阳性和已知阴性对照细胞滴定以确定其最佳染色浓度。我们在E11.5至P4的每日时间点收集小鼠DRGs，以提供连续的分子表达谱 (图1a)。对于胚胎时间点，将来自一窝胎的DRGs合并用于细胞分离和质谱细胞分析。对于出生后的时间点，首先按性别分离幼崽，然后合并DRGs，从每一窝中产生一个混合的雄性和雌性样本。每个发育时间点至少使用两个生物重复 (即混合凋落物)。分离后，将合并的DRGs解离到单细胞悬液中，然后与顺铂 (作为非细胞渗透活性染色剂)短暂孵育，之后将多聚甲醛(PFA)固定并在-80℃保存 (图1a)。

图1. 从E11.5到P4的DRG细胞类型的质谱分析

DRG流式细胞术与scRNA-seq分析的比较

为了确定基于蛋白质的流式细胞术测量结果与mRNA丰度之间的相关性，将我们的结果与具有紧密重叠时间点（E11.5、E12.5、E15.5、P0和P5）的scRNA-seq研究进行了比较。我们的抗体组有36种蛋白质，其同源mRNAs具有直接可比性，但其他标记物不具有直接可比性，如凝集素IB4和裂解的Caspase-3。由于mRNA和蛋白水平并非以线性或可预测的方式严格相关，我们首先比较了归一化平均表达量和表达这些蛋白mRNA同源对的细胞百分比。在每个匹配时间点加上接近时间点P4 (蛋白质)和P5 (RNA)进行该比较 (图7a)。在一些情况下，蛋白质表达与RNA表达密切相关，但对于大多数蛋白质mRNA同源对，表达水平相对趋势的时间存在较大差异。例如，转录因子Cux1、Islet1、MafA、NeuN、Sox1、Sox2和Sox10的蛋白表达均比RNA的表达出至少延迟5天，BFABP、GAD65、PGP9.5、TrkA、cMet、CD133、c-Kit、MAP2和GFAP的模式也类似。在极少数情况下，我们甚至看到蛋白质表达水平的相对趋势先于RNA (如Thy1和CD31)。

图7. DRG流式细胞术与scRNA-seq分析的比较

结论及展望

在本研究中，使用带有体感发育典型标记的抗体组，通过其蛋白表达谱鉴定了71种神经细胞类型 (图8a)。我们的小组提供了足够的交叉覆盖以识别细胞类型，即使在缺乏规范标记的情况下。例如，即使没有典型标记酪氨酸羟化酶，也可以通过低表达的TuJ1来识别C-ltmr。我们的数据集有超过550000个神经元，高通量特性揭示了罕见的同时表达多个Trk受体和过表达干细胞标记的神经元。我们的流式细胞术结果与以前的scRNA-seq数据之间的比较突出了转录物和蛋白质之间的复杂关系。因此，本研究表明，流式细胞术是一种高通量、可扩展的神经组织发育平台。

图8. DRG中躯体感觉的成熟和发展

原文链接

https://www.nature.com/articles/s41593-022-01181-8

参考文献

1.Keeler Austin B,Van Deusen Amy L,Gadani Irene C et al. A developmental atlas of somatosensory diversification and maturation in the dorsal root ganglia by single-cell mass cytometry.[J] .Nat Neurosci, 2022, undefined: undefined.

转自：“生物医学科研之家”微信公众号

如有侵权，请联系本站删除！