国自思路：精氨酸甲基化→促进翻译来调节卵泡发育

今天带来是来自中国科学院动物研究所干细胞与生殖生物学国家重点实验室于2021年8月27日发表在eLife ( IF 8.140 )上题为“PRMT5 regulates ovarian follicle development by facilitating Wt1 translation”的文章，即PRMT5通过促进 Wt1 翻译来调节卵泡发育。

蛋白质精氨酸甲基转移酶 5 ( Prmt5 ) 是负责精氨酸对称二甲基化的主要 II 型酶。作者的研究揭示了翻译后精氨酸甲基化在颗粒细胞分化和卵泡发育中的新作用。

1、颗粒细胞中 Prmt5 的缺失导致卵巢发育异常和女性不育

在 Prmt5flox/flox;Sf1+/cre 雌性小鼠中，颗粒细胞中PRMT5完全没有表达（图 1），而卵母细胞和间质细胞中 PRMT5 的表达不受影响，表明 Prmt5 是在颗粒细胞中特异性缺失。在成年Prmt5flox/flox;Sf1+/cre小鼠中未观察到明显的发育异常（图 1A）。然而，雌性小鼠因卵巢萎缩而不能生育（图1B）。在 Prmt5flox/flox;Sf1+/cre小鼠中仅观察到少量卵泡和少量黄体（图 1D）。在 Prmt5flox/flox;Sf1+/cre小鼠 (F) 2 周时观察到大量初级和次级阶段的生长卵泡，这与对照卵巢 (E) 的情况相当。在第 3 周 (G)，对照小鼠的许多卵泡进展到窦卵泡阶段，而 Prmt5flox/flox;Sf1+/cre小鼠的卵泡发育在第二阶段停滞。卵泡发育缺陷在第 4 周和第 5 周更加明显（图 1J 和 L）。卵母细胞周围的颗粒细胞数量急剧减少，卵泡结构被破坏。

图1

2、Prmt5flox/flox;Sf1+/cre小鼠中颗粒细胞的身份发生了变化

如图 3 所示，FOXL2 蛋白在 P14 和 P18 时在对照 (A、C) 和Prmt5flox/flox;Sf1+/cre小鼠 (B、D) 的颗粒细胞中表达。WT1 蛋白在 P14 和 P18 对照小鼠的原始、初级和次级卵泡的颗粒细胞中表达。在 P14 的 Prmt5flox/flox;Sf1+/cre小鼠的卵泡中也检测到 WT1；其中一些是 WT1 阴性（F，F'）。Prmt5flox/flox;Sf1+/cre小鼠在 P18很少有颗粒细胞是 WT1 阳性的（H，H’）。对照卵巢中的颗粒细胞呈立方形且组织良好（G'）。相比之下， Prmt5flox/flox;Sf1+/cre小鼠中的颗粒细胞变平（H'）并且与周围的基质细胞无法区分。

图2

如图 3 所示，在对照卵巢中，3β-HSD（Hsd3B1）和 CYP11A1（P450scc）在鞘膜间质细胞中表达（A、C）。在Prmt5flox/flox;Sf1+/cre小鼠的颗粒细胞中检测到 3β-HSD（B）和 CYP11A1（D）。SF1（NR5A1）仅在对照卵巢的膜间质细胞中表达（E），而在 Prmt5 缺陷的颗粒细胞（F）中检测到高水平的 SF1 表达，表明颗粒细胞发生了变化。无组织的层粘连蛋白染色（H）显示毛囊结构被破坏。

图3

PRMT5 及其相互作用伙伴 MEP50 的蛋白质水平在Prmt5flox/flox;Sf1+/cre颗粒细胞中显著降低（图 4A、B）。在 Prmt5 缺陷颗粒细胞中，Wt1 的 mRNA 水平没有改变；无论蛋白还是mRNA水平，类固醇生成基因 CYP11A1、StAR 和 NR5A1的表达显著增加；Cyp19a1 的 mRNA水平也显著增加（C）。PRMT5 特异性抑制剂EZP015666处理后WT1的蛋白水平显著降低，而mRNA水平没有变化；类固醇基因的表达在蛋白质和 mRNA 水平上均显著增加（图 4D、E 和 F）。这些结果表明 PRMT5 对颗粒细胞的影响取决于其甲基转移酶活性，PRMT5 是维持颗粒细胞身份所必需的，并且该基因的失活导致颗粒细胞过早黄体化。

图4

3、WT1的表达受PRMT5在翻译水平的调控

为了测试 Wt1 5'UTR 是否包含 IRES 元件，使用了 pRF 双顺反子报告基因构建体，其中上游海肾荧光素酶被翻译成帽依赖性，而下游萤火虫荧光素酶不会被翻译，除非存在功能性 IRES（图 5A）。与 pRF相比，萤火虫/海肾荧光素酶活性比率在 pRWT1F 转染细胞中显著增加；当 Wt1 5'UTR 以相反方向插入时，萤火虫/海肾荧光素酶活性比率没有增加（图 5B）。这些结果表明 Wt1 5'UTR 可能包含一个 IRES 元件。为了检查 Wt1 5'UTR 的哪一部分有助于其 IRES 活性，将 Wt1 5'UTR 分成三个片段并分别插入 pRF 构建体，并被转染到初级颗粒细胞中 (图 5C)。Wt1 IRES 活性在 EPZ015666 处理后显著降低（图 5D）。这些结果表明 PRMT5 通过在颗粒细胞中诱导其 IRES 活性在翻译水平上调节 Wt1 表达。

4、Wt1 IRES 活性受 PRMT5 通过 HnRNPA1 的甲基化调节

尽管 HnRNPA1 蛋白表达在对照和Prmt5flox/flox;Sf1+/cre颗粒细胞之间没有变化，但与对照颗粒细胞相比，Prmt5flox/flox;Sf1+/cre颗粒细胞中 HnRNPA1 的对称二甲基化水平显著降低（图 5E）。

图5

WB显示siRNA转染后HnRNPA1蛋白水平显著降低，颗粒细胞中 WT1 蛋白水平显著增加，EPZ015666 处理的颗粒细胞中 WT1表达的降低（图 6A）以及荧光素酶活性的降低（图 6B）被 HnRNPA1 的敲低部分逆转。HnRNPA1 在颗粒细胞中过表达，Wt1 IRES 活性显著降低（图 6D）。将四个精氨酸残基突变为赖氨酸（图 6C），发现与过表达野生型 HnRNPA1 的颗粒细胞相比，过表达突变体 HnRNPA1 的颗粒细胞中 Wt1 IRES 活性进一步降低（图 6D）。当用 EPZ015666 处理时，过表达突变体和过表达野生型 HnRNPA1 的细胞之间 Wt1 IRES 活性的差异消失了（图 6D）。免疫沉淀结果显示，精氨酸的突变不影响 HnRNPA1 和 Wt1 mRNA 之间的相互作用（图 6J）。

图6

5、Prmt5flox/flox;Sf1+/cre颗粒细胞中类固醇生成基因的上调被Wt1过表达抑制

来自Prmt5flox/flox;Sf1+/cre小鼠的颗粒细胞感染了对照或 GFP 标记的 WT1 表达腺病毒（图 7A、B）。Wt1 蛋白（图 7D、E）和 mRNA（图 7C）水平在 Wt1 过表达后 Prmt5 缺陷的颗粒细胞中显著增加。这些细胞中类固醇基因的表达显著降低。这些结果表明 WT1 可以挽救 Prmt5 缺陷颗粒细胞的异常分化。

转自：“学术查”微信公众号

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