先导化合物的反复优化以及候选药物临床阶段的低效率是药物开发时间长、成本高的主要原因。提高初始先导化合物的质量将极大程度地减少先导物优化周期，并促使候选药物进入具有更高特异性和亲和力的临床阶段。虚拟筛选以识别与受体蛋白上指定位点结合的小分子已成为药物发现中重要的组成部分1。特别的是，虚拟文库现在已经拥有超过200亿个化合物，在分子对接筛选过程中，从虚拟文库中筛选到了非常适合受体结合位点的新化学型，发现了在中pM到低nM范围内具有效力的配体。
六元氮杂环哌啶和吡啶是美国FDA批准的药物中最常见的两种环系。另外，非芳香哌啶还具有几个优点，例如有助于水溶性和氢键相互作用的碱性氮、可在多个位点引入取代基等2。四氢吡啶 (THPs) 是一类研究较少的六元氮杂环，它是介于吡啶和哌啶之间的不饱和中间化合物，与哌啶具有相同的有利属性。虽然THPs存在于一些天然产物衍生的药物中，如psychedelic lysergic acid diethylamide (LSD) 等，与其同类物哌啶和吡啶相比，此类化合物在大多数虚拟文库中的代表性不足。尽管在无偏的REAL按需合成文库中，16-18%的分子中含有哌啶和吡啶两种环系，但THP仅占0.35%。
2022年9月28日，美国耶鲁大学Jonathan Ellman实验室与美国北卡罗来纳大学Bryan Roth实验室合作，在Nature期刊上发表了题为Bespoke library docking for 5-HT2A receptor agonists with antidepressant activity的论文。研究者将定制的四氢吡啶虚拟文库与5-HT2A受体 (5-HT2AR) 模型对接，合成并测试了17个初始分子。基于结构优化得到了5-HT2AR激动剂 (R)-69 和 (R)-70，并且采用Cryo-EM技术解析了(R)-69与5-HT2AR的结合模式。与传统的5-HT2AR激动剂相比，这两种小分子都没有致幻活性，并且在小鼠模型中呈现出强大的抗抑郁活性。
研究者首先定制了一个四氢吡啶初始虚拟文库。其中，THP亚型(±)-1和(±)-2是从三种现成的输入物中制备的（图1b）。为了使生成的小分子具有可成药性，且最大限度地提高初始对接筛选过程中配体的命中率，研究者将分子质量限制在≤350 amu，得到了一个含有7500万个分子的虚拟文库。
为了寻找5-HT2AR的新配体，研究者使用了迭代计算和经验筛选策略（图1c）。研究者在结合了LSD的5-HT2BR晶体结构上构建了1000个同源模型，在建模过程中保留了LSD，以确保配体与合适的正构位点结合，选择了性能最好的5-HT2AR模型与THP库进行了筛选。每个库分子平均有92种构象，并在大约23,000个方向上进行了采样，总共对7.46万亿个复合物进行了采样和评分。最后，研究者合成了17个功能丰富的THPs。
图 1 定制的超大型虚拟文库
初步合成的THPs与5-HT2AR、5-HT2BR和5-HT2CR亚型进行了放射性配体置换试验，确定了4个抑制常数 (Ki) 值在0.67 μM到3.9 μM之间的分子，命中率为24%（图2a,b）。在5-HT2R亚型的功能测定中，这4种配体要么表现为激动剂活性，要么表现为拮抗活性，5-HT2BR的激动剂活性范围为1.9 ~ 3.0 μM。确认的配体对接结构表明，这4种配体都与保守的结合位点残基相互作用，包括THPs的三级胺和Asp1553.32之间的盐桥，这是胺能和血清素能GPCRs的特征相互作用（图2d）。由于5-HT2AR和5-HT2BR的正构结合位点高度保守，仅有4个残基变化，因此研究者假设，即使主要结合在5-HT2BR亚型的THP配体也可以优化以与5-HT2AR结合。
图 2 THP虚拟文库大规模对接筛选新的5-HT2R配体
接下来，研究者基于结构信息对配体进行了优化。首先，研究者合成了20个在C5位置保留吡啶环取代基的THP类似物，同时改变THP氮上的取代基, 并对其进行了结合分析。然后，研究者采用手性高效液相色谱 (HPLC) 分离出8个亲和力最高的外消旋类似物，并作为单个对映体测试其结合和功能活性。此外，研究者还发现，具有杂芳基的类似化合物来取代吡唑取代基效果更好，氮杂吲哚取代基提高了亲和力和功能活性。最后，研究者发现小的氮取代基提供了最大的激动剂活性，并在钙通量测定中鉴定出5-HT2AR强激动剂 (R)-69 和 (R)-70，EC50分别为41 nM和110 nM（图3）。激动剂 (R)-69 和 (R)-70 在结构上与最初的对接点相似，包括C5杂芳环取代，以及THP环中不饱和以及C3甲基取代基的重要性。此外，研究者实验证实，新型激动剂(R)-69 和 (R)-70对脱靶蛋白（5-HT2BR、5-HT2CR等）也有非常高的选择性，与传统激动剂相比，新型激动剂具有G蛋白偏好性，在中纳摩尔浓度时激活Gq信号，效果显著。
图 3 基于结构基础开发5-HT2AR激动剂和拮抗剂
为了对化合物进行进一步优化，研究者使用Cryo-EM技术确定了与 (R)-69结合的5-HT2AR的结构，分辨率为3.4 Å。基于结构信息，研究者发现，(R)-69与正构位点残基的相互作用包括与Asp1553.32的关键盐桥相互作用，以及 (R)-69的氮杂吲哚与Phe3406.52的π-π堆积相互作用（图4），以及多个其他的疏水相互作用，包括Val1563.33, Val2355.39, Trp3366.48和Phe3396.51。与经典激动剂相比，(R)-69在5HT2AR的正构位点中与其细胞质面结合相对较高，在位点更深处结合约两个环，更紧密地与残基如Phe339、Phe340和Ser242结合。
图 4 (R)-69结合5-HT2AR的结构图
最后，研究者对 (R)-69 和 (R)-70 展开了行为药理学分析。由于传统激动剂通常具有致幻性以及成瘾性等副作用，因此研究者们热衷于寻找一种新型激动剂，它既能保持抗抑郁作用，又不像传统致幻剂（如LSD和裸盖菇素）那样产生致幻作用。令人兴奋的是，在小鼠药代动力学研究中，(R)-69 和 (R)-70 均具有显著的脑通透性，进一步监测头抽搐反应 (HTRs) 后发现，不同剂量的 (R)-69和 (R)-70诱导极低水平的HTR，明显低于LSD。此外，研究者还测试了 (R)-69 和 (R)-70在小鼠遗传中抗抑郁的作用，结果证实在该小鼠遗传模型中，(R)-69和 (R)-70至少在24小时内具有抗抑郁药样作用（图5）。
图 5 小鼠中 (R)-69和 (R)-70的HTR，PPI反应和抗抑郁样作用
为了进一步研究 (R)-70的抗抑郁作用，研究者对C57BL/6J小鼠进行了习得性实验。小鼠被分为足休克 (FS) 和非足休克 (NFS) 两组，在FS小鼠表现出抑郁样行为后开始治疗。在 (R)-70和裸盖菇素的治疗下，小鼠的抗抑郁样效果立即（第0天出现急性效果），并在注射后持续3天以上，显著增加了FS小鼠的蔗糖偏好（图6）。后续还发现，(R)-70不仅在蔗糖偏好方面，而且在单次注射后持续数天的尾悬中同样具有抗抑郁药样活性。
图 6蔗糖偏好和尾巴悬挂用于习得性无助实验
总的来说，本文设计了一个基于结构信息筛选的超大型虚拟文库，以筛选在体外和体内具有活性的功能选择性激动剂。基于这个分子库，他们筛选到了两个新型激动剂，与传统激动剂不同，(R)-69和 (R)-70不仅具有抗抑郁药物的作用，但不具有相同的致幻药物作用，显示了一定的治疗潜力。更为重要的是，这种大型虚拟文库可能为迄今为止尚未研究发现的受体药物研发和药理学设计提供新的机会。
原文链接
https://www.nature.com/articles/s41586-022-05258-z#Sec9
转自：“北京生物结构前沿研究中心”微信公众号
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