溶酶体胱氨酸转运蛋白的结构与转运机制

在四十年前，胱氨酸驻积症（cystinosis）是第一个被发现由于溶酶体转运胱氨酸异常所导致的疾病，会使得细胞内产生晶体并对细胞和器官造成损伤【1】。从此，越来越多的其他溶酶体转运蛋白（及相关溶酶体驻积症）被发现，揭示了溶酶体膜蛋白转运系统丰富且重要的功能。溶酶体通常将生物大分子降解后的物质通过转运蛋白转运出溶酶体，这些转运蛋白通常都会利用溶酶体膜两侧的质子浓度梯度进行物质运输，溶酶体腔内的酸性环境是由V-ATPase所维持的【2】。尽管有着数年的生化、功能、遗传、生理研究，质子驱动的溶酶体氨基酸转运蛋白转运机制方面的研究仍然受限。

其中，质子依赖的溶酶体胱氨酸转运蛋白cystinosin可以将溶酶体内的胱氨酸转移至细胞质内侧，从而被还原为半胱氨酸。溶酶体cystinosin介导的胱氨酸外流可以调节细胞营养物质相关的TORC1信号通路，因此，cystinosin根据细胞内营养状态的调节来维持胱氨酸和半胱氨酸的供给起到了重要的作用【2】。

2022年9月15日，来自德克萨斯西南医学研究中心的李晓淳课题组，斯坦福大学医学院的冯亮课题组和加州大学圣克鲁斯分校的Glenn Millhauser课题组在Cell上发表了题为 Structure and mechanism of human cystine exporter cystinosin的文章。通过解析质子依赖的溶酶体胱氨酸转运蛋白cystinosin处于向腔内开口、向胞质内开口、结合底物胱氨酸三种状态的结构，揭示了胱氨酸的识别转运机制、不同构象的状态之间转换的分子机制，也为胱氨酸驻积症提供了潜在的治疗策略。

作者首先在体外重组表达cystinosin并与Fab结合制备冷冻样品，在pH7.5的条件下解析出了向腔内开口的结构（图1A），在pH5.0条件下解析出了向胞质开口的结构（图1B）。从结构中可以得到，cystinosin的N端结构域（NTD）从跨膜结构域（TMD）伸出，而TMD由7根穿膜螺旋组成，N端的1～3（N-THB）与C端的5～7（C-THB）呈现相似的3螺旋结构，之间由TM4相连（图1C）。NTD对于底物胱氨酸的转运至关重要，将其截短则会造成70%的活性丧失（图1D）。分析NTD与TMD交互界面可以发现其在两种状态间呈现出不同的相互作用方式（图1E）。

图1 cystinosin向腔内开口、向胞质开口的结构间比较

为了研究cystinosin结合和识别底物的机制，作者解析了其与底物胱氨酸结合的结构，发现在中央口袋处有密度刚好可以吻合（图2A）。而且发现结合底物的结构也是向腔内开口的状态（图2B）。不同于其他氨基酸转运蛋白可以转运多种氨基酸，cystinosin只能特异性地转运胱氨酸，结构中可以看见其拥有一个狭长的中央口袋，两个氨基与两个羧基均与口袋附近的残基形成氢键，而二硫键则主要靠周围残基的疏水相互作用（图2C）。这些氨基酸残基的突变都会导致转运活性的降低（图1D）。

图2 胱氨酸的结合与识别机制

在转运过程中，cystinosin向胞质开口和向腔内开口不同状态中门控残基起到了重要的作用。在向胞质开口状态中，其腔内存在着门控残基间形成的氢键网络维持蛋白的稳定（图3A），但是这些氢键在向腔内开口状态则不复存在，反而在另外一侧（胞质侧）存在着门控残基形成的氢键网络（图3B）。作者将这些门控残基突变进行转运活性检测，发现腔内门口残基突变会导致转运活性下降，而胞质侧门控残基突变则转运活性上升（图3C），呈现出Km减小，Vmax增加的活性上升状态（图3D）。

图3 转运过程中腔内和胞质侧的门控残基

为了更好地研究其处于向腔内开口和向胞质开口状态间的转变，作者利用了double electron-electron resonance spectroscopy (DEER)技术，将胞质侧和腔内侧氨基酸突变为Cys并带上标记，方便研究Cys-Cys间的距离（图4A），从而得到不同状态下胞质侧和腔内侧标记氨基酸的距离变化，向腔内开口则胞质侧标记残基距离较近，腔内侧标记残基距离较远，反之亦然（图4B）。分析不同的突变体可以得出，腔内门控残基的突变会使得蛋白更倾向于向腔内开口（图4C），而胞质侧门控残基突变则会使得蛋白更倾向于向胞质侧开口（图4D）。这些结果都说明了无论是腔内还是胞质侧的门控残基对于蛋白质构象的转换起到了重要的作用。

图4 cystinosin的构象变化

Cystinosin利用质子梯度将使得胱氨酸外流，为了研究质子和其构象变化的偶联关系，作者又测定了在不同pH（pH5.0～pH9.5）下Cys-Cys距离。在高pH下，蛋白更倾向于向腔内开口，而在低pH下更倾向于向胞质侧开口（图5A和图5B）。为了更清楚质子偶联介导构象改变的分子机制，作者检查了在转运过程中所有的酸性氨基酸，包括D205，D305和D346N，并测量其在pH5.2（倾向质子化）和pH7.4（倾向去质子化）下的Cys-Cys距离（图5C和图5D）。D205N会使蛋白在pH不依赖下倾向于向腔内开口，D205对于腔内门口的形成起到重要的作用，D205N会破坏腔内门控并造成更倾向于向腔内开口。D305N与WT一样会由pH改变其开口朝向状态。D346N呈现出pH不依赖下倾向于向胞质开口，作者认为D346是一个重要的转运质子化结合位点。

图5 cystinosin pH依赖的构象转变

综上，作者解析了质子依赖的溶酶体胱氨酸转运蛋白cystinosin处于向腔内开口、向胞质内开口、结合底物胱氨酸三种状态的结构（图6），揭示了胱氨酸的识别转运机制、不同构象的状态之间转换的门控残基，发现了腔内门控残基会减弱转运活性而胞质侧门控残基突变会增加转运活性，因此作者推测可以开发使得此蛋白质倾向于向外开口的小分子从而促进胱氨酸转运并治疗胱氨酸驻积症。但是本篇文章的研究仍然有一定的局限性，比如质子的转移过程仍然需要更清楚的阐释；转运循环中只捕捉到了向腔内开口和向胞质开口的状态，其他诸如阻塞状态仍然需要从而更好地解释转运循环。

图6 cystinosin转运底物胱氨酸的过程

原文链接

https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.08.020

转自：“北京生物结构前沿研究中心”微信公众号

如有侵权，请联系本站删除！