同源重组中促使分支迁移的RuvAB–Holliday 交叉复合物的结构解析

同源重组是一种基本的细胞过程，其对于维持基因的完整性及产生基因的多样性起到了重要的作用。在同源重组过程中，两条配对的同源双链DNA发生断裂，断开的单链交互重接，在分支点处形成由四条单链组成的Holliday交叉（Holliday junction，HJ），分支点可以发生移动，也被称为分支迁移（branch migration）（图1a）【1】。在原核生物中，RuvA和RuvB两种蛋白质在分支迁移中发挥了重要的作用，早期的生化实验证实RuvA四聚体组装在HJ周围使得双链DNA可以分离成单链，每条单链进入HJ侧部的两个RuvB AAA+ ATPase六聚体中，使得新生的重组DNA可以发生分支迁移（图1b）【2】。但是目前没有RuvAB-HJ复合物的相关结构，以及RuvB如何促进DNA的移位这一重要生物学过程的分子机制仍不清楚。

图1 HJ的形成及RuvAB-HJ复合物促使的分支迁移过程【3】

2022年8月24日，来自德国汉堡大学的Thomas C. Marlovits课题组在Nature上发表了题为Mechanism of AAA+ ATPase-mediated RuvAB–Holliday junction branch migration 的文章。通过时间分辨的冷冻电镜技术和单颗粒分析，解析了RuvAB-HJ复合物的结构，得到了复合物7种不同的构象，这些构象揭示了RuvAB-HJ复合物在分支迁移过程中ATP水解、核苷酸交换、DNA移位的具体信息，提出分支迁移过程中新的分子机制及原理。

作者通过将原核生物生物的RuvA、RuvB蛋白质与DNA在体外进行组装，并使用冷冻电镜解析其结构。由于高度柔性，RuvAB-HJ复合物整体结构的分辨率为8 Å（图2a），其中8个RuvA分子对称组成了2个四聚体（3.3 Å），4条单链进入1个或者2个RuvB六聚体组成三部分复合物（2.9～4.1 Å）或者二部分复合物（3.9 Å）（图2b）。在所有类型的颗粒中，都是DNA以双链形式进入RuvA的核心，在离开时以单链形式与另一DNA的单链组合穿入RuvB的中心马达（图2d）。其中，RuvA核心通过RuvAD3结构域与RuvB马达相连，说明其可能存在控制RuvB运动的方式（图2c）。由于此复合物的高度动态性，作者进行后续的3D分类分析，发现RuvB呈现60度旋转运动，从而呈现不同的构象介导分支迁移（图2e）。

图2 RuvAB-HJ复合物的冷冻电镜结构

作者在后续额外的3D分类中，发现了RuvB马达分子呈现出了9个不同的构象密度图，分辨率为2.9 Å～4.1 Å，其中3.9 Å和4.1 Å的密度图无法进行无偏差的分析，所以文章后部分没有进行讨论，而剩余的7个被分为，1个不结合RuvAD3的密度图（s0-A），2个结合1个RuvAD3的密度图（s0、s1）和4个结合2个RuvAD3的密度图（s2、s3、s4、s5）。在所有的RuvB马达蛋白中，六聚体（A～F亚基）中的A、B、C、D四个亚基形成一种螺旋楼梯样式的结构，并与DNA的磷酸基团相结合（图3a和图3b）。其中每个亚基结合2个bp（图3c），富含Arg氨基酸带正电的结构域与带负电的磷酸基团相结合（图3d）。

图3 RuvB马达的构造及其构象的多样性

根据不同构象间RuvB马达中Cα的位置，作者将RuvB六聚体分为稳定的（白色）、柔性的（蓝色）及中间状态的区域，其中B和C亚基较为稳定，E和F亚基较为柔性，而A和D亚基则处于中间状态（图3e），说明了在分支迁移过程中不同亚基的柔性是不同的。而不同亚基之间也存在着一定的构象差异（图3f）。

为了衡量6个亚基在5种状态下一共30种构象间的差异，作者通过引入RuvB亚基中3个特定角度来进行定量研究，发现E亚基在5种状态下的差异最大（图4a）。而分析E亚基在5种状态下的移动轨迹，可以发现其移动了7 Å（图4b），刚好对应了2 bp的DNA移位距离，说明这5种状态呈现了一次完整的移位步骤。

为了分析ATP水解与RuvB构象变化间的关系，作者分析了30种核苷酸结合口袋，总结如图4c，可以发现，对于A亚基在s2～s3状态时发生了ATP的水解，而D亚基在s1～s2状态时发生了ADP的释放，在s4～s5状态时发生了ATP的结合，B和C亚基在5种状态下都是ATP结合，E和F亚基在5种状态下都是ADP结合。对于整个RuvB马达来讲，在s1～s2状态时释放ADP、s2～s3状态时水解ATP，s3～s4状态时释放镁离子，s4～s5状态时结合ATP（图4d），而亚基A位于螺旋楼梯的顶部、亚基D位于底部，说明核苷酸循环与DNA移位存在着内在的关系。同时，作者发现每个亚基在s5状态下的构象与逆时针相邻亚基在s1状态下的构象较为接近，说明其存在着一个逆时针转动的过程（图5e），比如A亚基的s5状态逆时针转动变为F亚基的s1状态，当转动发生时，口袋内的核苷酸也都没有发生变化（图5c）。作者将这一转动过程称之为集群转换（cluster switch），每一个亚基的发生的反应也会在其相邻的亚基中陆续发生。

图4 RuvB的动态性及核苷酸结合口袋分析

通过以RuvAD3结构域作为固定点，将五种状态的结构进行比对，发现RuvB向上移动（图5a），在一次循环中通过拉力将DNA移动了2 bp的距离（图5b）。作者提出了DNA移位的杠杆模型，即以RuvAD3结构域为支点，RuvB在杠杆上施加机械力，使得DNA向上移动，造成DNA在RuvAB-HJ复合物中分支迁移。随后恢复s1状态，进行接下来的循环（图5d）。

图5 RuvB通过杠杆原理来促进底物移位

最终，作者构建了一个DNA在RuvAB-HJ复合物分支移动的模型，分为两个阶段（图6）：

第一阶段为初始阶段，这一阶段不发生移位反应，（1）RuvA结合到HJ处并通过RuvAD3结构域招募RuvB组装形成六聚体；（2）RuvB六聚体随机组装核苷酸（ATP或ADP）并通过ATP水解或者核苷酸交换从而使得其为s1状态。

第二阶段为移位阶段，这一阶段发生具有顺序性，（1）RuvB六聚体经历s1～s5五种状态水解ATP，将ATP的化学能转为机械能造成“杠杆移动”，使得DNA移位；（2）每次移位的距离为2 bp；（3）通过集群转换不断进入下一循环，使得DNA在RuvAB-HJ复合物进行分支移动。

图6 RuvAB-HJ复合物促进DNA分支移动的模型

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41586-022-05121-1

转自：“北京生物结构前沿研究中心”微信公众号

如有侵权，请联系本站删除！