环核苷酸介导的螺旋结构激活TIR免疫效应蛋白的结构与分子机制

环核苷酸第二信使在原核生物抵御病毒的过程中起到了关键的作用，比如通过III型CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，规律成簇的间隔短回文重复）[1]、CBASS（Cyclic nucleotide-Based Antiphage Signaling Systems，基于核苷酸的抗噬菌体信号系统）[2]和PYCSAR（PYrimidine Cyclase System for Antiphage Resistance，抗噬菌体的嘧啶环化酶系统）[3]。这些系统可以激活强力效应的蛋白来摧毁细胞内诸如核酸、辅因子或细胞膜这种重要的组成成分来破坏病毒的扩增[4]。TIR结构域就是其中之一，它作为酶可以降解NAD+从而造成感染病原体的植物细胞死亡、细菌防御噬菌体的Thoeris免疫反应、TIR-STING系统等等[5]。TIR结构域激活需要效应蛋白亚基的组装，但是其分子机制还未研究得很清楚。

2022年8月10日，来自英国圣安德鲁斯大学的Malcolm F. White课题组在Nature上发表了题为Cyclic nucleotide-induced helical structure activates a TIR immune effector的文章，作者揭示了细菌的抗病毒反应可以产生环三腺苷酸，结合TIR-SAVED效应蛋白，像胶水一样使其组装为超螺旋的螺线管结构，相邻的TIR亚基相互作用组成了可以降解NAD+的活性位点。同时也通过体外和体内试验验证了纤维的形成是其激活的关键因素，本项研究通过发现由环核苷酸控制的大尺度分子组装机制，揭示了TIR酶激活机制的关键细节。

III型CRISPR和CBASS系统都通过SAVED结构域（SMODS-Associated and fused to Various Effector Domains）来作为环核苷酸结合的结构域[6]，作者聚焦于革兰氏阳性菌Microbacterium ketosireducens的II-C型CBASS系统，其包含核苷酸环化酶（CD-NTase）、TIR-SAVED结构域和其他组分（图1a）。通过薄膜色谱分析发现ATP可以被CD-NTase催化反应生成环三腺苷酸cA3（图1b和图1c）。作者利用可以NAD+类似物ɛNAD+来研究TIR-SAVED的活性，若其被TIR-SAVED所降解则可以产生荧光信号（图1d）。通过将CD-NTase和TIR-SAVED所催化的反应相偶联，发现在ATP存在的情况下，CD-NTase的产物可以激活TIR-SAVED效应蛋白来降解NAD+（图1e）。

图1 CBASS系统产生cA3作为第二信使来激活TIR-SAVED的NADase酶活性

通过X射线小角散射，作者发现TIR-SAVED在apo状态下更倾向于形成单体，而在添加了cA3后则粒子大小会显著增加，说明存在大分子量的复合物（图2a），也说明cA3的结合会介导TIR-SAVED的多聚化。通过冷冻电镜则发现TIR-SAVED在cA3的驱动下形成了有序的纤维样结构，这一复合物被定义为右手超螺旋螺线管，直径约为22nm，螺距为14nm，每一圈由17个TIR-SAVED单体组成（图2b）。作者在后续的部分使用四个TIR-SAVED原聚体来进行结构分析（图2c）。

在密度图中可以清晰地看见cA3小分子的密度位于头尾相接的SAVED结构域结合口袋处（图2d和图2e），其与SAVED亚基1的 W394和K199及互补亚基2的R388相互作用（图2e）。由此可见，SAVED结构域头尾相接的组装堆叠方式可能是由环核苷酸cA3所介导的，也是TIR-SAVED激活不可缺失的因素。在结构中可以看见TIR结构域也呈现多聚化，TIR亚基1的BB曲环与亚基2的DE曲环相互作用（图2e和图2f），作者做出假设相邻TIR结构域组成了NADase酶活性位点，将BB曲环的D45或L46突变则造成酶活性完全丧失（图2g），而DE曲环的Y115突变则会造成Km的增加和Vmax的降低，说明其更像催化位点而不是结合位点（图2g）。

图2 TIR-SAVED组装形成的活性复合物的结构

虽然多聚化会使得相邻的TIR结构域组成活性位点，但是这并不能说明额外螺旋结构的必要性及其与功能之间的联系，所以作者额外设计了三种不同的突变体进行体外和体内功能实验的研究。突变体E（E84Q）在TIR活性位点突变，虽然可以多聚化但是缺乏NADase酶活性，突变体R（R388E）在亚基2的cA3结合位点上改变了电性的氨基酸突变，无法多聚化但是保留了结合cA3的能力，双突变体KW（K199E/W394A）是亚基1上的cA3结合位点突变，无法多聚化也无法结合cA3（图3a和图3b）。

虽然这三个突变是无活性的，但是它们可以用来结合产生进一步不同突变的TIR-SAVED复合物。首先，作者尝试R和KW突变体的组合，可以组合成二聚体，R突变体构成亚基1而KW突变体构成亚基2（图3a），其可以结合cA3（图3b）但是没有NADase活性（图3c）。所以接下来作者尝试R和E突变体的组合，这种情况下形成的纤维只有1个R突变体和不同数目的E突变体结合延伸（图3a）。在体外功能实验中，随着E比例的增加，其切割NAD+的活性则越来越强，说明在仅有一个NADase活性位点的情况下，TIR-SAVED纤维的长度越长，其活性越高（图3c）。这也说明具有催化能力的TIR结构域组装为多聚体，而不仅仅是二聚体。作者在体内实验中通过切割NAD+造成细菌死亡表征TIR的NADase功能，得到了相同的结论（图3d）。

图3 NADase酶活性需要TIR-SAVED的寡聚化

综上，作者通过研究CBASS系统中的TIR-SAVED效应蛋白，发现其在结合cA3后可以寡聚化来发挥NADase酶功能来降解NAD+，从而导致细菌死亡；揭示了其寡聚化是一种“开放对称”（可以多聚无限个）的状态，也是原核生物先天性免疫广泛存在的机制。但是作者分析称，其得到的结构可能不是一种激活状态的结构，可能需要更大的复合物来稳定其激活状态。

原文链接

https://doi.org/10.1038/s41586-022-05070-9

转自：“北京生物结构前沿研究中心”微信公众号

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