北京时间2022年10月27日晚23时，北京大学药学院王晶团队联合北京大学生命科学学院伊成器团队在Nature Biotechnology杂志在线发表题为“Absolute quantification of single-base m6A methylation in the mammalian transcriptome using GLORI” 的研究论文。
该研究开发的新方法GLORI (Glyoxal and nitrite-mediated deamination of unmethylated adenosine) 突破了现有m6A检测技术的局限性。GLORI不依赖于抗体，首次实现了高灵敏度、高特异性、无偏好的检测单碱基m6A位点，同时对m6A位点的修饰水平进行绝对定量（图1）。
m6A是高等真核生物mRNA内部含量最丰富的修饰，目前认为~0.2-0.6%的腺苷中存在m6A修饰【1,2】。研究发现m6A由甲基转移酶METTL3和METTL14与WTAP等核心复合体（“书写者”）组成的甲基转移酶复合物添加形成【3-8】，并可以通过去甲基化酶FTO和ALKBH5（“擦除者”）被“擦除”【9,10】。同时，有多种含有YTH结构域的识别蛋白，包括YTHDF1-3 , YTHDC1-2等可以识别RNA上的m6A修饰并招募相关RNA到不同的目标蛋白复合体中，进一步调控m6A标记mRNA的功能和命运【11-15】。近些年的研究揭示，m6A可通过其识别蛋白广泛参与pre-mRNA剪接、RNA输出、mRNA翻译和RNA降解等生物学过程【16】。
研究者们已经开发了多种m6A检测方法，尽管这些技术在一定程度上已经促成了m6A研究领域的多种重大进展，现有的m6A方法仍然存在几个重要的局限性。目前为止，检测m6A的高通量测序技术主要有三大类：（1） 基于m6A抗体的检测方法。此方法能够检测m6A，但是无法获得其高分辨率的位点信息【18-19】。（2）基于限制性内切酶的检测技术。该技术能够检测到单碱基m6A的信息且能够对m6A进行定量，然而，该技术只能检测含有ACA 基序的m6A。（3）基于三代测序和机器学习的方法。这种方法能够提供m6A的单碱基信息且能够进行定量，然而三代测序存在价格昂贵、检测准确性低等问题，且不能够实现对m6A的绝对定量。迄今为止，对m6A的无偏好检测和绝对定量仍未得到解决。
GLORI技术核心是通过化学反应组合筛选发现乙二醛和亚硝酸盐的催化体系，对未甲基化的腺苷进行高效地脱氨从而形成肌苷(A-to-I, > 98%)，肌苷在逆转录过程中和胞苷配对，进而在测序过程中被读成鸟苷(G)，形成A-to-G的转化；而m6A则保持不变，测序后仍被读成A (图1a-c)。GLORI通过检测测序的读段序列中A所占的比例，实现了对单碱基m6A的绝对定量(图1d)。在概念上，GLORI技术类似于利用亚硫酸氢盐定量检测基因组5mC的含量。
图1：GLORI 的检测原理。a, GLORI实现A-to-I的转化。b, GLORI的化学反应过程。c, GLORI中乙二醛和亚硝酸盐介导脱氨作用前后（上）和（下）的LC-MS/MS分析。d, GLORI技术在基因MRPS26上定量检测m6A位点的例子。
GLORI技术不依赖于抗体，并具有高灵敏度和高特异性的检测m6A。首先，该团队在HEK293T转录组中，鉴定出了176,642个m6A位点(图2a)，并且发现，随着测序深度的增加，可检测的m6A位点可以进一步的增加，该结果扩展了人们对mRNA上m6A存在数量的认识。此外，GLORI技术能够实现对m6A的准确定量：即使修饰水平较低的m6A（5%），GLORI也能够实现准确检测(图2b)。重要的是，GLORI检测m6A位点的修饰水平具有很高的技术重复性(图2c)，提示了GLORI定量检测良好的稳定性。随后分析发现，约91%的GLORI检测位点符合m6A的经典序列DRAC (D=G/A/T, R=A/G)，且这些位点都富集在转录本的终止密码子附近、CDS和3’UTR，也符合现有研究对m6A的广泛认识。
利用GLORI技术，研究者们进一步描绘了HEK293T中m6A的定量图谱。在整个转录组中，m6A的甲基化水平的中位数约40%，转录组上整体的m6A修饰水平呈现“马鞍形”的分布(图2d)，约38%的m6A位点的修饰水平超过了50%。随后对含有不同m6A修饰水平的mRNA进行功能分析发现，mRNA上整体m6A的修饰水平和RNA的转录水平(图2e)及翻译效率(图2f)都呈现负相关关系。至此，GLORI首次实现了全转录组的m6A定量图谱，也完成了对基因表达和翻译调控的定量评估。
图2：GLORI转录组内定量检测m6A。a, GLORI在HEK293中检测的位点。b, GLORI能够准确检测spike-in中m6A位点的修饰水平。c, GLORI检测的m6A位点的修饰水平在技术重复之间的相关性。d，HEK293中m6A位点修饰水平的整体分布。e, 含有不同m6A修饰水平的mRNA的转录水平。f, 含有不同m6A修饰水平的mRNA的翻译效率比较。
此外，该团队发现在一些基因的特定区域中出现了一类聚集分布的m6A位点（m6A簇，图3a）。随后的分析发现, 转录组中~33%的m6A位点会参与形成这种m6A簇，而形成m6A簇的相关位点具有更高的m6A修饰水平(图3b)。相比于不具有这类m6A簇的基因，这类m6A簇的基因显著降低基因的转录水平(图3c)和翻译效率(图3d)，从而负调控基因的表达。
图3：m6A簇的发现与功能。a, SPEN基因的特定区域有聚集分布的m6A簇。b,参与形成m6A簇的m6A位点具有显著高的修饰水平。c,具有m6A簇的mRNA具有显著低的转录水平。d,具有m6A簇的mRNA具有显著低的翻译效率。
最后，该团队进一步将GLORI技术应用于热休克及缺氧的两种压力体系和HeLa及MEF两种细胞系中观察m6A的动态调控，并提供了转录组上m6A对压力条件应激的定量图谱。作者们发现在两种压力体系下约有4.8-11% m6A位点具有动态变化，并且上调和下调的m6A位点表现出不同的富集模式：在缺氧时，上调和下调的位点分布富集在5′UTR和终止密码子附近(图4a)，而热休克体系中这种富集则呈现相反的趋势(图4b)。不同于野生型细胞中m6A对基因表达的负调控作用：在热休克条件下，m6A整体修饰水平升高的mRNA的翻译效率显著上调(图4c)，且这种上调的调控作用在具有m6A簇的mRNA中更为显著(图4d)。该结果提示了m6A在不同环境下对基因表达中具有特异性的调控。
图4：GLORI检测动态变化的m6A。a, 缺氧诱导m6A位点的mRNA分布图谱。b, 热休克诱导m6A位点的mRNA分布图谱。c, 热休克前后MEF细胞中上调m6A相关基因翻译效率的箱线图和点图。d, 热休克后具有或不具有m6A簇的基因的翻译效率的箱线图。
综上可述，基于GLORI在检测m6A方面的优异表现，他将有助于推动和解决m6A在细胞分化、胚胎发育和临床检测等多种领域中的功能研究和核心生物学问题, 有望成为定量m6A测序技术的“金标准”。
北京大学药学院王晶研究员和北京大学生科院伊成器教授为本研究论文的通讯作者。北京大学生命科学院博士后刘聪、博士生孙含笑、北京大学药学院博士后衣云鹏（已出站）、直博生申卫国和北京大学生命科学院李楷为共同第一作者。该工作得到科技部重点研发计划和国家自然科学基金委等项目资助。
相关论文信息：
https://www.nature.com/articles/s41587-022-01487-9
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