北京时间2022年10月27日晚23时，美国芝加哥大学何川教授团队在Nature Biotechnology在线发表了标题为“Quantitative sequencing using BID-seq uncovers abundant pseudouridines in mammalian mRNA at base resolution”的研究论文。
该研究提出并开发了对mRNA上Ψ修饰进行单碱基分辨率、定量测序的测序方法（Bisulfite Induced Deletion sequencing），简称BID-seq。BID-seq以高精度测序谱图揭示了在人类细胞系和动物组织的mRNA上数以千计的显著性Ψ位点（>10%修饰化程度，modification fraction），以及大量的高修饰Ψ位点（>50%修饰化程度）。
何川教授团队以此进一步鉴定了mRNA上Ψ修饰的“书写蛋白”，发现了高修饰Ψ位点对mRNA代谢的影响，以及论证了哺乳动物mRNA的终止密码子上天然存在的Ψ修饰。
近年来， DNA与RNA甲基化修饰及其发挥的重要生物学功能受到了表观遗传学、生物医学等领域的广泛关注。在RNA修饰（RNA modification）领域，除了经典的核糖体RNA（rRNA）和转移RNA（tRNA）上的诸多种类的RNA修饰，信使RNA（mRNA）上的RNA修饰在近几年得到了科学界的广泛研究。6-甲基腺嘌呤（m6A）被鉴定为哺乳动物信使RNA（mRNA）上最高丰度的甲基化修饰，也是迄今为止功能最广范的mRNA修饰，其通过影响mRNA的降解、翻译、出核运输、剪接等过程，从而显著调控细胞的基因表达 【1,2】。在哺乳动物mRNA上，除了丰度最高的m6A，还存在着多种已被证实的mRNA修饰，例如假尿嘧啶（pseudouridine，Ψ）、5-甲基胞嘧啶（m5C）、1-甲基腺嘌呤（m1A）、2’-氧甲基化（2’-O-methylation, Nm）、mRNA内部的7-甲基鸟嘌呤（internal m7G）等（图1）。根据质谱学定量，其中假尿嘧啶（Ψ）在mRNA上的丰度与m6A最为接近，是目前发现的哺乳动物mRNA第二大修饰。
图1. 人类mRNA上RNA修饰的大致丰度。
由于m6A修饰在mRNA上的高丰度以及已有的针对m6A的高效特异性抗体，基于IP的m6A-MeRIP-seq被广泛用于对mRNA m6A的位点分布进行测序，从而推动了对mRNA上m6A生物学功能的大量研究。然而，Ψ作为哺乳动物mRNA上丰度第二高修饰，其在mRNA上的是否发挥着重要的调控功能目前尚不完全清楚。长期以来，在针对mRNA上Ψ生物学功能的研究中，最大的瓶颈就是缺乏一种像m6A-MeRIP-seq这样的高效测序方法。所以，如何以单碱基分辨率对mRNA上的Ψ位点进行定量测序，一直是RNA表观转录组领域的一个难题。
在方法的开发过程中，研究人员通过对bisulfite化学反应机制的研究 【3,4】，筛选出来了能够将Ψ修饰完全转化为Ψ-BS复合物的化学反应条件 (图2A)，并进一步优化使反转录酶在反转录过程中在Ψ-BS复合物位点处跳跃读取下一位碱基，构成在Ψ-BS位点处的碱基缺失信号（deletion signature），从而实现了Ψ修饰的单碱基分辨率测序方法；在此过程中产生的deletion信号强弱，可被用于衡量此处Ψ修饰化程度的高低，为mRNA上Ψ修饰的定量测序、动态监测铺平了道路 （图2B）。由于BID-seq的核心步骤完全基于化学反应，使得该方法不需要任何酶促反应，整体流程易于操作与重现，在很大程度上可以与经典的的DNA 5mC的bisulfite测序方法媲美。值得一提的是，与传统的bisulfite反应不同，BID-seq的化学反应条件只针对于Ψ修饰，并不产生任何C到U的转化，完全保留了mRNA片段在测序中的序列复杂度。
图2：BID-seq策略图。（A）BID-seq化学处理可将Ψ完全转化为Ψ-BS复合物。（B）BID-seq测序建库流程图。
首先，为了验证方法的效率和普适性，研究人员合成了包含NNΨNN 256种motif context的RNA探针，BID-seq在231个motif上呈现>50%的deletion率，并在252个motif上呈现>25%的deletion率，此高效性是将BID-seq大规模用于生物样本的基石 （图3A）。随后，研究人员将BID-seq运用在了HeLa、HEK293T和A549细胞系并鉴定出500~1000个显著性Ψ位点（>10%修饰化程度），同时在老鼠组织中也鉴定了1000~7000个显著性Ψ位点 (图3B)。这些位点很大一部分体现出高修饰化程度 （>50% modification fraction）(图3C)，并集中分布在转录本上的CDS、3’ UTR以及终止密码子附近。虽然显著性Ψ修饰位点在细胞系的mRNA上仅有几百个，在不同动物组织里的mRNA上基本都在几千左右，总体丰度和m6A基本接近， 预示了哺乳动物体内mRNA上广泛存在的调控机制。在技术层面，BID-seq不依赖于任何抗体，可实现对微量RNA样本（10~20 ng RNA）中的Ψ位点进行测序，在单碱基分辨率追踪Ψ修饰化程度的动态变化。
其次，通过构建一系列针对Ψ修饰酶（PUS，pseudouridine synthase）的基因敲除细胞系，研究人员发现mRNA上Ψ修饰可由8种不同的PUS酶分别调控，其中以TRUB1和PUS7最为显著。并且，由TRUB1调控的一系列高修饰Ψ位点（>50%修饰化程度），体现出与mRNA稳定性的密切关系。值得一提的是，我们知道体外合成的mRNA终止密码子上的Ψ修饰会导致终止密码子的读通性改变【5,6】 ，而由于测序技术的瓶颈，人们一直无法论证哺乳动物mRNA终止密码子上是否有天然存在的Ψ。在此项研究工作中，BID-seq在HeLa细胞和十二种老鼠组织中鉴定出了一百多条mRNA在终止密码子上携带显著性Ψ位点（>10%修饰化程度），并发现这些Ψ对于一部分mRNA终止密码子的读通性产生明显改变，这一结果回答了RNA表观转录组领域的长期疑问。
图3：BID-seq揭示哺乳动物mRNA上广泛存在的Ψ修饰位点及其修饰化水平定量。（A）BID-seq对于合成的RNA探针上NNΨNN（100%修饰程度的Ψ）256种不同的motif体现出高deletion率。（B）BID-seq所揭示的mRNA上Ψ位点数目。（C）BID-seq所揭示的mRNA上Ψ位点的修饰化程度（modification fraction）。
BID-seq攻克了Ψ定量测序技术瓶颈，为研究mRNA上Ψ修饰在诸多生理或病理过程中的位点分布、修饰化程度动态变化、生物学功能等，奠定了技术基础，有望与最新开发的m6A-SAC-seq【7】携手引领RNA表观转录组领域步入新的阶段。
相关论文信息：
https://doi.org/10.1038/s41587-022-01505-w
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