Science Advances 封面｜丹麦研究人员建立作物性状快检方法FIND-IT，加速新绿色革命

在 1960 年代和 1970 年代的绿色革命期间，高产品种的集约化农作方式解决了全球粮食短缺问题；但由于不可再生资源的大量使用，这一方式也给环境带来了严重的负面影响。为了更好地应对未来的全球粮食需求并尽量减少对气候变化的影响，在全球范围内掀起了新一轮的绿色革命，并在玉米、小麦和水稻等主要作物中产生了一系列优良的高产品种。然而，转基因作物的认同度仍很低，目前有30多个国家限制转基因作物的生产，转基因作物的耕地面积只占到了可用耕地的15%。

具有低自发突变密度的大型自然变异种群，一直是传统育种用于驯化作以获得卓越的自然基因变异的主要来源。诱变可增加种群的遗传变异；化学诱变处理主要诱导单核苷酸突变，可在短时间内获得具有数千个有用且以前未识别的大型变体群体。虽然通过表型或基因组靶向筛选，可用于筛选出自然或诱导变异群体的理想性状；但能被成功定位的基因仍很有限，效率非常低。

2022年8月24日，Science Advances在线发表了丹麦嘉士伯实验室Birgitte Skadhauge和Christoph Dockter团队及其合作者题为“FIND-IT: Accelerated trait development for a green evolution”的方法论文。该研究建立了一种快速筛选基因变异的技术方法FIND-IT，结合化学诱导突变，它可以对大型突变体库的不同突变类型（敲除突变、错义突变和非编码区突变等）进行高通量的鉴定和分离，从而实现对所需作物性状的鉴定，加速作物的新绿色革命。

DOI: 10.1126/sciadv.abq2266

为了解决上述问题，该研究建立了一种快速筛选非转基因变异的技术方法FIND-IT（Fast Identification of Nucleotide variants by droplet DigITal PCR）。ddPCR（droplet digital PCR）技术的灵敏度是传统PCR 的1000倍；利用这一技术，FIND-IT可将样本进行合并和拆分，以筛选大型、低突变密度的变异群体，从而实现所需性状的鉴定。在筛选过程的第一阶段，FIND-IT可将包含目标突变体的群体从初始库的所有个体缩小到单个候选池。在第二阶段，FIND-IT来自候选池中的个体DNA进行二次取样，并重复ddPCR程序，进一步减少子池中携带变异的候选个体数量。在第三阶段，通过对最后有限个体进行PCR和基因测序，来确认目标基因的变异（Figure 1）。

为了匹配FIND-IT 的下游应用，该研究通过叠氮化物或烷基化诱变剂的温和处理，建立了一系列的大型突变体库，包括大麦（Hordeum vulgare）、小麦、油菜、燕麦、酵母和细菌等。其中，大麦突变体库是使用叠氮化钠（NaN3）生成的，其主要突变类型为G:C-A:T。

为了证明 FIND-IT在靶向定位特定基因突变中的优异性，该研究以大麦突变体库为例，并将目标筛选集中在色氨酸残基替换为终止密码子的突变（Trp>stop）。通过对总计 500,000 个大麦个体的突变体文库进行筛选，研究人员鉴定并分离出100个基因的突变体；功能分析表明，这些基因与大麦的多个性状相关，如籽粒、花序等（Figure 2）。

除了基因敲除之外，FIND-IT还能够识别和分离错义突变以及基因非编码区（比如启动子）的突变，从而微调基因转录和基因活性。为了证实这一点，研究人员分离出了超过50个具有单碱基变异的突变体；它们或改变了基因的转录水平（比如GRF4的miRNA396结合位点），或改变了蛋白质的氨基酸序列。其中，25个突变体的种子被分离、繁殖并储存在-20℃以供进一步研究（Figure 3）。

综上所述，该研究建立了FIND-IT快筛方法和相应的种质资源，该方法通过样本合并和拆分，可对各类大型、低突变密度的变异群体进行单核苷酸水平上的基因突变筛选，地分离出个敲除突变、错义突变、miRNA结合区和启动子区突变等；从而有针对性地鉴定所需性状。FIND-IT可适用于田间或培养生长的任何生物体，可加速作物的新绿色革命。

转自：“植物科学最前沿”微信公众号

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