经典 ！ PCR 引物设计的十大黄金法则（看到就是赚到）

好的引物会让 PCR 实验成功一半，引物设计一直都是PCR非常重要的环节。然而，当实验室小白遇上引物设计，往往一片迷茫，不知所措……

今天，大师兄给大家总结了 PCR 引物设计的 10 条黄金法则，可谓经典当中的经典，看到就是赚到！

• 引物最好在模板 cDNA 的保守区内设计

DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件比对，各基因相同的序列就是该基因的保守区。

• 引物长度一般在15~30碱基之间

引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

• 引物 GC 含量在 40%~60% 之间，Tm值最好接近 72℃

上下游引物的 Tm 值是寡核苷酸的解链温度。有效启动温度，一般高于 Tm 值 5~10℃，其 Tm 值最好接近 72℃ 以使复性条件最佳。

• 引物 3′ 端要避开密码子的第 3 位

如扩增编码区域，引物 3′ 端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

• 引物 3′ 端不能选择 A，最好选择 T

当末位链为 T 时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于 A、T 之间，所以 3′ 端最好选择 T 。

• 碱基要随机分布

降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

• 引物自身及引物之间不应存在互补序列

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。

• 引物的 5′ 端可以修饰，而 3′ 端不可修饰

引物 5′  端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等，引物的延伸是从 3′ 端开始的，不能进行任何修饰。

• 扩增产物的单链不能形成二级结构

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。

• 引物应具有特异性

引物设计完成以后，应对其进行 BLAST 检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一，光是在引物设计这一步，就非常考验耐心和细节。好在丁香实验早就给大家整理了好了关于 PCR 的实验方法、步骤、经验等精华内容，还有问答广场，实时帮助大家解决遇到的实验问题，48 小时内给出解决方案！

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