2022/4/21 8:50:48 阅读：327 发布者：chichi77
研究思路
研究结果
膳食胆固醇自发驱动 NAFLD-HCC 的发展
为了检查膳食胆固醇在脂肪变性、NASH、纤维化和NAFLD-HCC 演变中的作用，给小鼠喂食 HFHC、HFLC 或 NC。在不同时间点（3、8、10、12 和 14 个月）监测血清甲胎蛋白（AFP，肝癌标志物）水平。与喂食 HFHC 的小鼠相比，在第 10 个月观察到 AFP 水平升高（107.1±127.9 ng/mL），在第 12 个月（151.6±129.3 ng/mL）和第 14 个月（174.2±203.1 ng/mL）进一步升高在第 14 个月使用 HFLC（HFLC 中为 50.9±7.5 ng/mL）或 NC（59.7±20.9 ng/mL）（图 1A）。MRI 扫描显示 HFHC 喂养的小鼠在第 14 个月时出现肝肿瘤，但在 HFLC 喂养或 NC 喂养的小鼠中没有发现（图 1B ）。然后在第 14 个月收获小鼠。在 68% (13/19) 喂食 HFHC 的小鼠中发现肝肿瘤，但在喂食 HFLC 或 NC 饮食的小鼠中没有发现肝肿瘤（图 1C）。肝脏切片的组织学检查证实所有肝脏肿瘤均为 HCC（图 1C），每只小鼠平均有 2.7±2.6 个 HCC，最大肿瘤直径为 4.1±5.0 mm。与 HFHC 喂养的小鼠相比，HFHC 喂养小鼠的肝脏切片中 Ki-67 阳性细胞明显增多，表明 HFHC 喂养小鼠的细胞增殖增加（图 1C）。这些结果表明，膳食胆固醇可以自发诱导 NAFLD-HCC 的形成。
随着 HCC 的形成，与 NC 喂养的小鼠相比，HFHC 喂养的小鼠在第 14 个月时体重、内脏脂肪、肝脏重量和肝体重比显着增加（图 1D）。喂食 HFLC 的小鼠体重、内脏脂肪和肝脏重量也有所增加（图 1D）。与 HFLC 喂养或 NC 喂养的小鼠相比，HFHC 喂养的小鼠的血清胆固醇、肝脏游离胆固醇和胆固醇酯、葡萄糖耐受不良和空腹胰岛素显着增加（图 1E）。与 NC 相比，在喂食 HFLC 的小鼠中也观察到增强的葡萄糖耐受不良和空腹胰岛素（图 1E）。
图1 | 胆固醇在 C57BL/6 小鼠中诱导自发 HCC 形成
a)喂食 HFHC 饮食 3、8、10、12 和 14 个月的小鼠以及喂食 NC 或 HFLC 饮食 14 个月的小鼠的血清 AFP 水平；
b)肝脏 MRI,
c)喂食 NC、HFLC 和 HFHC 14 个月的小鼠肝脏中 Ki67 染色的代表性大体形态、代表性显微特征和免疫组织化学, Ki-67 根据以下标准评分: 0 ( <10 %细胞染色）、1（11 % –30% 细胞染色）、2（30 % –50% 细胞染色）或 3（>50 %细胞染色）
d)喂食 NC、HFLC 的小鼠的体重、内脏脂肪、肝脏重量、肝脏重量比、
e)血清胆固醇水平、肝脏游离胆固醇、肝脏胆固醇酯含量、葡萄糖耐量试验和空腹胰岛素水平和 HFHC 14 个月。
喂食高胆固醇饮食 14 个月的小鼠出现 NASH 和纤维化
HFHC 喂养的小鼠表现出严重的纤维化损伤，胶原分布区域显着增加（图 2E），通过肝羟脯氨酸测定法测定的胶原含量（图 2F）和肝星状细胞活化，如增加的 α-平滑肌肌动蛋白 (α-SMA) mRNA 和蛋白质水平（图 2E）。对肝脏氧化应激的检查显示，在 HFHC 喂养的小鼠中，氧化的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+) 与 NADH（NAD 的还原形式）的比率和抗氧化超氧化物歧化酶 (SOD) 活性显着降低（图 2G），表明肝脏氧化饮食胆固醇的压力。总的来说，这些发现表明 NASH 和纤维化是在 HFHC 喂养小鼠的非 HCC 肝组织中形成的。
图2 | 胆固醇在喂食 HFHC 饮食的小鼠的非 HCC 肝组织中引起 NASH 和纤维化。
a)具有代表性的 H&E 染色、肝切片的组织学评分；
b)血清 ALT 和 AST 水平；
c)用 NC、HFLC 和 HFHC 喂养 14 个月的小鼠通过细胞因子分析测定的血清 IL-6、IL-1α 和 IL-1β 蛋白水平；
d)用 HFLC 和 HFHC 喂养的小鼠的 RNA 测序通过 ELISA 和 Cx3cl1、Mcp1、Cxcl10、Mip1β、Mip1α、Ccl5、Cxcl16、Tnfα mRNA 水平测定肝脏促炎细胞因子 IL-6、IL-1α 和 IL-1β 蛋白水平14个月；
e)天狼星红染色的胶原沉积，免疫组织化学染色和 RT-PCR 的 α-SMA 蛋白和 mRNA 水平
f)肝脏羟脯氨酸含量
g)用 NC、HFLC 和 HFHC 喂养 14 个月的小鼠的肝脏 NAD+ 与 NADH 比率和 SOD 活性。
高胆固醇饮食在小鼠中依次导致脂肪肝、脂肪性肝炎和纤维化
为了阐明饮食胆固醇在 HCC 形成之前 NAFLD 的进展，我们监测了喂食 HFHC 的小鼠的血清 ALT、AST、胆固醇、AFP 和肝脏组织学变化。在饮食喂养后 3、8、10 和 12 个月收获小鼠（图 3A）。我们观察到在 3 个月和 8 个月时，与喂食 HFLC 的小鼠相比，喂食 HFHC 的小鼠的体重和内脏脂肪重量增加，同时肝脏重量和肝体重比增加。血清 ALT 和 AST 的增加与 HFHC 喂养的小鼠血清胆固醇水平升高一致。HFHC 喂养小鼠的肝脏组织学显示，3 个月时有轻度炎症的脂肪变性，8 个月时伴有纤维化的脂肪性肝炎，10、12 和 14 个月时有 HCC 形成，而 HFLC 喂养的小鼠在 3、8 个月时仅显示脂肪变性而没有进一步的 HCC 发展。10 个月和 14 个月（图 3B）。我们还对两种 HCC 标志物 AFP 和高尔基蛋白 73 (GP73) 进行了免疫组化。
在 HFHC 喂养小鼠的肝组织上观察到阳性染色，但在 HFLC 喂养的小鼠身上没有观察到阳性染色。肝脏脂肪变性、小叶炎症和肝胶原区域的评分证实了整个疾病阶段肝脏组织学的严重程度增加（图 3B）。此外，10% (1/10) 的 HFHC 喂养小鼠在 10 个月时发展为 HCC（肿瘤数 = 0.1 ± 0.32，最大肿瘤直径 = 0.55 ± 1.74 mm），25% (3/12) 在 12 个月时发展为 HCC（肿瘤数=0.25 ± 0.45，最大肿瘤直径=1.57 ± 3.10 mm) 和 68% (13/19) 在 14 个月时发展为 HCC（图 3C），表明 HFHC 喂养的小鼠逐渐发展为脂肪变性、脂肪性肝炎、纤维化和 NAFLD–肝癌。
图3 | 喂食 HFHC 的小鼠依次发展为脂肪肝、脂肪性肝炎、纤维化和 HCC
a)用 HFHC 饮食治疗 C57BL/6 小鼠的示意图。在 3、8、10 和 12 个月大时处死小鼠。
b)喂食 HFLC 14 个月和喂食 HFHC 3、8、10、12 和 14 个月的小鼠肝脏中肿瘤标志物 AFP 和 GP73 的代表性大体形态、H&E 染色和 IHC 染色；计算脂肪变性和炎症的组织学评分以及天狼星红染色的定量。
c)不同时间点喂食 HFHC 的小鼠的最大肿瘤的肿瘤发病率、肿瘤数量和最大肿瘤直径。
在 NAFLD-HCC 的发生和发展过程中，膳食胆固醇诱导的肠道菌群失调
对细菌丰度与小鼠表型的潜在关联相关性分析。我们观察到M. schaedleri_Otu03 8, Desulfovibrio_Otu047, Anaerotruncus_Otu107, C. celatum_Otu070 , C. cocelatum_Otu036和C.methylpentosum_Otu053在 HFHC 喂养小鼠的粪便样本中富集呈正相关（图4F），而Bifidobacterium_Otu026, B. acidifac 、A. municiphila_Otu034和Lactobacillus_Otu009在 HFHC 喂养的小鼠中被耗尽，与高胆固醇饮食、血清和肝脏胆固醇水平呈负相关（图 4F）。这些结果表明 NAFLD-HCC 中的肠道菌群失调与胆固醇水平相关。
为了证实我们在人类患者动物实验中的发现，我们分析了 59 例高胆固醇血症患者和 39 名健康受试者的血清胆固醇和肠道微生物群的相关性。双歧杆菌和拟杆菌与血清总胆固醇和低密度脂蛋白 (LDL)-胆固醇呈负相关，但与高密度脂蛋白 (HDL)-胆固醇呈正相关（图 4G）。这些结果与喂食 HFHC 的小鼠的观察结果一致，进一步推断肠道微生物群参与了胆固醇诱导的疾病。
图4 | 膳食胆固醇诱导的肠道菌群失调。
a)14 个月 HFLC 和 HFHC 喂养的小鼠之间的主成分排序分析 (PcoA)、香农多样性和肠道微生物群的丰富度。
b)喂食 HFLC 或 HFHC 14 个月的小鼠粪便中细菌的热图。
c)分别喂食 3 个月、8 个月和 14 个月的 HFHC 后肠道菌群的 PCoA 和冗余分析。
d)通过 chao1 指数测量的微生物群丰富度，并在 HFHC 喂养的 3、8 至 14 个月内依次增加细菌。
e)HFLC 喂养和 HFHC 喂养小鼠的肠道微生物群色氨酸代谢能力。
f)细菌丰度与小鼠表型的相关性。
g)宏基因组测序与血清总胆固醇、甘油三酯、59 例高胆固醇血症人类病例和 39 名健康受试者中的 LDL-胆固醇和 HDL 胆固醇。
膳食胆固醇通过诱导代谢物改变促进 NASH-HCC 进展
进一步的实验表明，高膳食胆固醇不能改变胆汁酸合成酶的 mRNA 表达，包括肝脏中的细胞色素 P450 (Cyp)7a1、Cyp8b1、Cyp27a1 和 Cyp7b1（图 5F）。额外的体外实验表明，TCA 在人类正常永生化肝细胞系 LO2 中加重了胆固醇诱导的甘油三酯积累（图 5G），而 IPA 抑制了 NASH 中胆固醇诱导的脂质积累（图 5G）和细胞增殖（图 5H）– HCC细胞系，HKCI-2和HKCI-10。这些结果表明，胆固醇通过调节宿主血清代谢物以及至少部分通过增加 TCA 和减少 IPA 来促进 NASH-HCC 进展。
图5 | 膳食胆固醇诱导的小鼠血清代谢谱的改变。
a)通过主成分排序分析，喂食 HFLC 和 HFHC 饮食的小鼠的血清代谢物显着不同。
b)喂食 HFHC 饮食的小鼠中差异富集的代谢物的途径分析。
c)喂食 HFLC 和 HFHC 饮食的小鼠血清代谢组学火山图，显示了代谢物的异常值。
d)喂食 HFLC 和 HFHC 饮食 3 个月的小鼠门静脉血液中的 LPS 浓度和喂食 14 个月 HFLC 和 HFHC 饮食的小鼠结肠组织中 E-钙粘蛋白的表达。
e)HFHC 改变的微生物和代谢物关联的相关性分析。
f)喂食 HFLC 和 HFHC 饮食的小鼠肝组织中 Cyp7a1、Cyp8b1、Cyp27a1 和 Cyp7b1 的 mRNA 水平。
g)通过油红 O 染色，TCA 加重了胆固醇诱导的人 LO2 细胞系中的甘油三酯积累，而 IPA 抑制了 NASH-HCC 细胞系、HKCI-2 和 HKCI-10 中胆固醇诱导的甘油三酯积累。胆固醇，200 μg/mL；
h)IPA 抑制 NASH-HCC 细胞系中的细胞增殖。
高胆固醇调节的肠道微生物群促进无菌小鼠的脂肪性肝炎和肝细胞增殖
图6 | 高胆固醇调节的微生物群促进无菌小鼠模型中的肝细胞增殖
a)粪便从 NC 喂养、HFLC 喂养和 HFHC 喂养的小鼠（14 个月）移植到 NC 下的无菌小鼠（G-NC、G-HFLC 和 G-HFHC）。显示了 G-NC、G-HFLC 或 GHFHC 组灌胃无菌小鼠肝脏的大体形态、组织学检查和 Ki-67 染色。
b)G-NC、G-HFLC 或 G-HFHC 组的受体无菌小鼠在 8、10 和 14 个月时的肝脏甘油三酯含量、脂质过氧化和肝脏组织学。
c)G-NC、G-HFLC 或 G-HFHC 组在 14 个月时的肝脏 IL-6 蛋白水平和
d)Ki-67 染色。(E1) G-NC、G-HFLC 或 G-HFHC 小鼠肝组织中的小鼠癌症通路 Finder PCR 阵列。
e)CDC20 蛋白水平得到验证。
f)G-NC、G-HFLC 或 G-HFHC 小鼠肠道菌群线性判别分析 (LDA) 得分的主成分排序分析和直方图。
g)G-HFLC 和 G-HFHC 小鼠的血清代谢组学分析。
图7 | 胆固醇抑制消除了 HFHC 喂养小鼠的 NAFLD-HCC 进展
a)喂食 HFHC 饮食的 C57BL/6 小鼠的阿托伐他汀治疗示意图。
b)用或不用阿托伐他汀治疗的 H&E 染色 HFHC 喂养的小鼠肝脏的代表性总体形态和显微特征，计算脂肪变性、炎症和胶原蛋白的组织学评分。
c)血清胆固醇水平、肝脏游离胆固醇水平、血清 AFP 水平
d)血清 ALT 水平、肝脏 NAD+ 与 NADH 比率、肝脏 SOD 活性、血清 IL-6、IL-1α、IL-1β、MCP-1、在接受或不接受阿托伐他汀治疗的 HFHC 喂养小鼠中，MIP-1α、MCP-1β 蛋白水平、
e)胶原沉积和羟脯氨酸含量。
f)用或不用阿托伐他汀治疗的 NC、HFLC 和 HFHC 喂养的小鼠粪便中细菌的细菌丰富度和热图图。
g)HFHCat 粪便灌胃无菌小鼠 (G-HFHCat) 中肝脏的大体形态、组织学检查、甘油三酯和脂质过氧化
h)胆固醇诱导的 NAFLD-HCC 发展机制示意图
研究讨论
尽管胆固醇在 NASH 中是一种已知的细胞毒性脂质，关于胆固醇在 NASH 引起的 HCC 发展中的作用和重要机制的信息是有限的。在这项研究中，我们首次证明长期高膳食胆固醇喂养会导致小鼠自发性 NAFLD-HCC 发展。我们研究了高膳食胆固醇从 NAFLD 发展为 HCC 的主要机制。我们发现喂食高胆固醇饮食的小鼠在 NAFLD-HCC 中 ROS 积累增加。积累的 ROS 是一种有毒介质，可诱导炎症反应、胰岛素抵抗和氧化损伤。事实上，我们的分析表明，膳食胆固醇会诱导 ROS 和促炎细胞因子，从而促进 NASH 和 HCC 的发展。我们的研究结果为肠道菌群失调在胆固醇诱导的 NAFLD-HCC 进展中的潜在作用提供了新的见解。除了肠道菌群失调外，共生细菌产生的小分子代谢物也可能导致 NAFLD 的发病。我们的研究结果表明，胆固醇可能会损害胆汁酸代谢和微生物色氨酸代谢，导致血清 TCA 升高，IPA 降低，从而促进 NAFLD-HCC 的发展。阿托伐他汀治疗的 HFHC 喂养小鼠的粪便不会促进受体无菌小鼠的肝细胞增殖。这些观察结果进一步强调了阿托伐他汀在预防胆固醇诱导的 NAFLD-HCC 发展中的潜在用途。
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