1、文献题目
Single-atom nanozymes
文献期刊：Sci. Adv.
10.1126/sciadv.aav5490
2、文献作者
汪劲，纽约州立大学（SUNY）石溪分校化学和物理学系教授，1991年获得美国伊利诺伊大学天体物理博士。研究兴趣包括生物分子折叠的机制、分子网络的底层原理、从景观和流理论视角研究经典和量子非平衡统计物理、复杂环境中的反应动力学等。
董绍俊，中国科学院长春应用化学研究所电分析化学国家重点实验室学术委员会顾问。研究方向为电化学/电分析化学的基础与应用。重点研究包括以下五个方面：化学修饰电极，纳米/自组装膜界面电化学，生物电化学和生物传感器，光谱电化学以及环境水质分析与监测。
3、文献提出的科学问题
传统的纳米酶因复杂的尺寸、组成和表面依赖性催化和固有的低活性位点密度从而面临巨大挑战。
4、分解为几个研究目标
1、通过MOF包裹的铁酞菁(FePc) (FePc@ Zn-MOF)，然后在N2气氛下在900℃热解前体以获得单原子纳米酶。
2、通过比色法测定了FeN5 SA/CNF的氧化酶样活性。通过简单改变MPc@Zn-MOF前驱体的热解温度、有机配体和金属酞菁(MPc)的常规方法制备了一系列参考催化剂，研究了不同环境下O2分子与FeN5 SA/CNF的相互作用。
3、通过比较FeN5 SA/CNF对正常结肠粘膜(NCM460)细胞活力的影响来进行细胞毒性实验。进一步通过稳态动力学分析和电子顺磁共振(EPR)分析以及理论计算，阐明FeN5 SA/CNF增强的氧化酶样活性的来源。
5、研究总体方案
以氧化酶催化作为模型反应，实验研究和理论计算揭示了具有碳纳米框架限制的FeN5活性中心(FeN5 SA/CNF)的单原子纳米酶的催化行为类似于轴向配体配位的细胞色素P450酶。明确的活性部分和关键的协同效应赋予FeN5 SA/CNF明确的电子推动效应机制，以及其他纳米酶中最高的氧化酶样活性(速率常数比商业Pt/C高70倍)和多种抗菌应用。
6、方法和技术手段
SEM、ac HAADF-STEM、XRD、FT-IR、UV-vis、DFT、Fluorescence microscopy、Mössbauer spectrum
7、主要研究成果
1、通过MOF包裹的铁酞菁(FePc) (FePc@ Zn-MOF)，然后在N2气氛下在900℃热解前体以获得单原子纳米酶。以前的工作表明，在铁卟啉和FePc的煅烧过程中，正方形平面FeN4位点将被保留，但单分散的位点在没有基底支撑的情况下倾向于聚集成纳米颗粒。在碳化过程中，含氮有机连接基的二级结构单元转化为吡啶碳纳米框架，而锌离子蒸发。同时，碳纳米框架内孤立的FeN4位点被重构并与吡啶N底物配位以产生热力学更稳定的FeN5/C位点。SEM和TEM图显示纺锤形FePc@Zn-MOF是具有均匀形貌的主要产物。前驱体的平均长度和直径分别为400 nm和200 nm。中空腔和多孔壳赋予FePc@Zn-MOF高比表面积和丰富的分层纳米孔。XRD图表明原位包封FePc后，Zn-MOF的晶体结构没有发生明显变化。FePc@Zn-MOF的傅里叶红外(FTIR)光谱表明FePc封装成功。FePc@ Zn-MOF前驱体900℃热解制备的FeN5 SA/CNF保持了其原有的形貌和多孔性。FeN5 SA/CNF的比表面积达到1407 m2 g−1，平均孔径为0.8 nm和3.4 nm。高分辨率透射电镜(HRTEM)图像、选择区域电子衍射和XRD图均未显示出可观察到的颗粒或特征晶峰，不包括纳米颗粒的形成。FeN5 SA/CNF的原子分辨率扫描TEM (STEM) z对比图像证实了碳纳米片上原子分散的铁原子的存在，多个区域的观察表明，FeN5 SA/CNF中只有单个的铁原子存在。电子能量损失谱(EELS)成像图像显示Fe和N原子均匀分布在整个区域，表明Fe - N位在三维矩阵中生成。电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和元素分析分别了铁(1.2wt %)和N (4.8 wt %)元素的负载量。
2、利用x射线光电子能谱(XPS)、x射线吸收精细结构(XAFS)和Mössbauer光谱进一步表征了FeN5 SA/CNF的原子结构。XPS Fe 2p谱在711.2 eV (Fe 2p3/2)和724.5 eV (Fe 2p1/2)的结合能处显示两个峰。XPS N 1s光谱可以主要解卷积为吡啶N，其衍生自有机连接体，可以作为连接FeN4活性中心的连接位点。Fe箔、Fe2O3和FePc作为参考的FeN5 SA/CNF的Fe K边缘x射线吸收近边缘结构(XANES)在图中示出。出现在样品中的7117 eV处的前沿峰类似于FePc，表明FeN5 SA/CNF样品包含类似的FeN4结构。Fe K-edge处FeN5 SA/CNF的傅里叶变换k3-加权扩展XAFS (FT-EXAFS)光谱在1.55Å处呈现主峰，这与Fe-N散射路径一致，并且没有检测到Fe-O键(1.50Å或Fe-Fe键(2.13Å),表明在FeN5 SA/CNF中形成了原子分散的Fe-N位。对第一配位层进行相应的EXAFS拟合，以确定铁原子的结构参数和定量化学构型。Fe原子的配位数接近5，这表明在FeN5 SA/CNF中形成了Fe-N5部分。基于Fe57核对γ射线的无反冲吸收，我们用穆斯堡尔谱研究了FeN5 SA/CNF的电子结构和铁配位。穆斯堡尔谱根据异构体位移(δiso)和四极分裂(ΔEQ)值解卷积成三个不同的双峰。具有0.13mm S1的最小δiso值和2.75mm S1的最大ΔEQ值的第二个偶极子的独特的四极偶极子可以归属于具有五个配位菱形单锥体结构的N-FeIIIN4中等自旋物种。第二个双峰相对吸收面积(24.65%)表明FeN5 SA/CNF中FeN5部分的含量最高。
3、我们用比色法测定了FeN5 SA/CNF的氧化酶样活性。以3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)的氧化反应为模型催化反应，研究了不同环境下O2分子与FeN5 SA/CNF的相互作用。我们通过简单改变MPc@Zn-MOF前驱体的热解温度、有机配体和金属酞菁(MPc)的常规方法制备了一系列参考催化剂。HRTEM和高角度环形暗场STEM (HAADF-STEM)图像显示没有可观察到的颗粒，排除了这些催化剂中纳米颗粒的形成。MNx SA/CNF的FT-EXAFS光谱在k边缘呈现对应于M-N散射路径的主峰，并且检测到金属键，表明在这些催化剂中形成了原子分散的M-N位。优化了FeN5 SA/CNF的合成及类氧化酶活性测试条件，FeN5 SA/CNF的氧化酶样活性高度依赖于热解温度。在900℃下热解FePc@Zn-MOF前体后，碳纳米框架和FeN5活性中心的最佳重建导致类似于氧化酶的催化结构和更有效且更易接近底物的活性位点。FeN5 SA/CNF比其他FeNx SA/CNF和FePc表现出更高的氧化酶样活性。此外，即使当测试温度延长至60℃和催化剂分别经历21小时的强酸(碱)处理时，FeN5 SA/CNF仍可保持至少80%和90%的氧化酶样活性。与FeN5 SA/CNF在空气饱和缓冲液中的652 nm处的时间依赖性吸光度相比，FeN5 SA/CNF催化的TMB氧化的反应速率显示出在O2饱和条件下的显著增加和在N2饱和条件下的急剧降低。这些表明FeN5 SA/CNF在催化O2还原中的强烈催化作用，并且TMB的氧化速率高度依赖于O2浓度。然后，我们系统地研究了FeN4 SA/CNF和MN5 SA/CNF的类氧化酶活性。如图所示，在FeN5 SA/CNF的催化下，氧化TMB (oxTMB)的吸光度在1分钟内立即达到1.0任意单位(a.u .)，远高于其他催化剂的吸光度。在溶液中观察到明显的颜色变化；随着时间的推移，使用不同的催化剂，无色的TMB可以转化为蓝色的oxTMB。通过归一化吸光度计算TMB氧化的初始反应速率，FeN5 SA/CNF表现出最高的氧化酶样活性0.44 µM S-1，比FeN4 SA/CNF高17倍。类氧化酶活性的实验顺序为FeN5 SA/CNF > MnN5 SA/CNF > CoN5 SA/CNF > FeN4 SA/CNF > NiN5 SA/CNF > CuN5 SA/CNF，表明中心金属原子和轴向5 - N配位结构对单原子纳米酶同样重要。这些因素的协同作用使FeN5 SA/CNF具有优异的类似氧化酶的特性。此外，与大多数具有类似氧化酶特性的纳米颗粒(如CeO2, Fe3O4, MnO2, CuO, Au, Pd, Pt和普鲁士蓝)相比，FeN5 SA/CNF具有类似氧化酶的活性，即使只有1.2 wt %的铁含量也优于这些纳米酶。FeN5 SA/CNF的催化速率常数(kcat)是商用Pt/C的70倍。FeN5 SA/CNF的单原子纳米酶表现出比其他传统纳米酶高30至1000倍的类氧化酶催化速率常数。这表明铁原子具有优异的类氧化酶活性是由于其高度分散的原子位和内在配位结构。抗坏血酸(AA)对TMB氧化反应的抑制作用使FeN5 SA/CNF对抗氧化剂敏感。随着AA浓度的增加，TMB的氧化速率逐渐降低，oxTMB的吸光度与AA浓度在0.1 ~ 10µM范围内呈良好的线性关系，检出限为0.07µM。鉴于其高氧化催化活性和独特的催化作用在类似氧化酶的途径中，FeN5 SA/CNF的单原子纳米酶在催化还原氧的过程中会产生活性氧或氧化应激，从而严重破坏细菌的膜完整性，提高抗菌效率。为了准确评价FeN5 SA/CNF的抗菌活性，我们进行了体外抗菌实验。与对照组相比，暴露于FeN5 SA/CNF的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细胞的细菌存活率明显降低，表明FeN5 SA/CNF的高氧化酶样活性可以显著增强其抗菌活性。基于荧光的活-死细胞分析显示，在与FeN5 SA/CNF孵育后，大多数细菌发出红色荧光，碘化丙啶(PI)染色，表明发生了显著的膜损伤。SEM图像中细胞膜的破坏与荧光分析一致，细菌受到严重破坏，细胞形态丧失，并且广泛的膜破坏导致细胞崩溃。
4、我们通过比较FeN5 SA/CNF对正常结肠粘膜(NCM460)细胞活力的影响来进行细胞毒性实验。即使在高浓度的FeN5 SA/CNF(500µg ml−1)下，细胞系也未观察到明显的毒性。我们使用在Balb/c小鼠上的实际伤口感染模型的体内抗菌实验来评估FeN5 SA/CNF的实际抗菌功效。在大肠杆菌感染和治疗后4天的伤口观察中，我们观察到与对照组相比，用FeN5 SA/CNF治疗的小鼠溃疡明显缓解，伤口愈合加快，这与感染伤口的苏木精和曙红(H&E)染色相一致。染色结果显示，角质形成细胞从正常组织向创面部位迁移，治疗后正常皮肤切片表皮逐渐变完整变厚。综上所述，合成的FeN5 SA/CNF是具有高度生物相容性的杀菌纳米酶。
5、通过稳态动力学分析和电子顺磁共振(EPR)分析，进一步研究了FeN5 SA/CNF的催化机理。我们使用通过改变TMB浓度得到的典型米氏曲线，通过Lineweaver-Burk方程计算米氏常数(Km )。FeN5 SA/CNF的低Km值揭示了FeN5活性中心对TMB的超高亲和力，FeN5 SA/CNF的最高kcat/Km值表明比其它催化剂高得多的催化效率。此外，高价Fe(IV)═O中间体(化合物I或II铁)被认为是含血红素酶的催化循环中的一种可能的和必要的活性瞬态，其通常也存在于血红素类似物中。为了验证FeN5 SA/CNF的FeN5活性位点是否产生血红素中所见的Fe(IV)═O中间体，我们通过FeN5 SA/ CNF与过量的苯基氧碘(PhIO)在77 K下的反应进行了EPR光谱分析。g ≈ 2.03处的典型菱形标记信号与η2-过氧血红素物质一致，表明Fe(IV)═O中间体的形成以及与氧化酶的类似反应过程。由于SCN与FeN5部分的强配位和FeN5 SA/CNF的中毒，FeN5 SA/CNF的氧化酶样活性随着过量KSCN的加入而迅速降低。这表明原子分散的FeN5位点也是这些催化剂中的实际活性中心。
6、为了阐明FeN5 SA/CNF增强的氧化酶样活性的来源，我们对在酸性条件下以TMB分子作为还原剂的单原子金属位点上的氧分子还原过程进行了密度泛函理论(DFT)计算。根据所提出的四电子路径，用自由能的变化来表示结果。首先，我们在与吡啶N耦合的石墨烯基体中构建了FeN4结构，作为FeN5 SA/CNF的优化计算模型。鉴于NiN5 SA/CNF和CuN5 SA/CNF的类氧化酶活性可忽略，且过渡态不可实现，本文研究了FeN4 SA/CNF、MnN5 SA/CNF、FeN5 SA/CNF和CoN5 SA/CNF的活性类氧化酶催化剂。O2吸附的第一步决定了电子从活性中心向被吸附中间体转移的活性。计算出的吸附能(ΔG* O2)表明不同的吸附强度对不同催化剂的吸附构型有不同的影响。对于最高ΔG*O2，吸附*O2在FeN5 SA/CNF上的O─O距离远大于游离分子O2 (1.23 Å)。这表明强吸附使O─O键变弱，使O─O键伸长幅度增大。O─O键的减弱可归因于在吸附过程中，通过轴向配位氮的电子推动作用转移的电子填充了O2的反键π*轨道。这种行为与细胞色素P450的轴向硫酸盐配体的强内电子供体相似。另一方面，正方形平面FeN4 SA/CNF的超低ΔG*O2 (0.05 eV)导致O2的弱吸附和O─O键的活化，从而限制了反应速率和氧化酶样活性。MnN5 SA/CNF和CoN5 SA/CNF具有中等的ΔG*O2，但CoN5 SA/CNF较高的G*O导致第三步高能势垒(*OOH + H+ + e−→*O + H2O)，因此MnN5 SA/CNF比CoN5 SA/CNF更能裂解吸附的*OOH的O─O键。根据这些能量学计算得到的类氧化酶活性顺序为FeN5 SA/CNF > MnN5 SA/CNF > CoN5 SA/CNF > FeN4 SA/CNF，与实验结果一致。与方形平面的FeN4 SA/CNF相比，额外的轴向配位N原子使FeN5 SA/CNF具有较强的电子推动效应，激活O2，有利于O-O键的裂解，从而促进brønsted-碱吸附的氧物质在氧化底物的过程中从底物获取酸性氢(TMB)的氧化能力。同时，在温和条件下，中心金属Fe原子和轴向N配位结构之间的协同效应有效地优化了FeN5 SA/CNF上各过渡态的自由能。因此，DFT计算明确地确定了中心金属原子和单原子纳米酶的立体构型是优越的氧化酶样活性的来源。
8、作者给出结论
1、开发了一类新的单原子纳米酶，它们在纳米材料中具有原子级分散的酶样活性位点。相对于传统的纳米酶，最大化的原子利用效率和明确定义的活性部分显著增强了催化性能，并揭示了潜在的机制。
2、以氧化酶催化为模型反应，实验研究和理论计算表明，合成的FeN5 SA/CNF单原子纳米酶的催化行为类似于氧化还原酶的轴向配位血红素。电子推动效应机制和关键的协同效应使得FeN5 SA/CNF具有其他纳米酶中最高的类氧化酶活性。
3、FeN5 SA/CNF在体外表现出广谱杀菌性能，在体内表现出有效的伤口消毒。
转自：“科研一席话”微信公众号
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