1、文献题目
Atomization-Induced High Intrinsic Activity of a Biocompatible MgAl-LDH Supported Ru Single-Atom Nanozyme for Efficient Radicals Scavenging
文献期刊：Angew. Chem. Int. Ed.
10.1002/anie.202307133
2、文献作者
刘军枫，北京化工大学化学学院，化工资源有效利用国家重点实验室，教授，博士生导师。主要研究方向是无机功能纳米材料及其在催化、能源领域的应用。包括单原子催化剂、LDHs基纳米酶和抗氧化剂、金属有机框架（MOF）基催化材料、电催化氧还原、CO2还原、N2还原等新型催化材料。
3、文献提出的科学问题
由于传统纳米酶的活性不足，开发模拟天然酶清除活性自由基的有效纳米酶仍然存在重大的挑战。
4、分解为几个研究目标
1、研究了Ru1/LDH的POD酶活性，用密度泛函理论研究了Ru1/LDH上H2O2氧化反应的途径。
2、通过多种测试考察了Ru1/LDH对O2·、·OH、NO·和DPPH·的清除能力。
3、进一步采用2′，7′-二氯荧光素(DCFH-DA)作为荧光探针研究了Ru1/LDH在细胞内的抗氧化活性。
5、研究总体方案
报道了一种新的钌单原子纳米酶(SAE)，其特征是在生物相容的镁铝层状双氢氧化物(Ru1/LDH)上原子分散的钌原子。所制备的Ru1/LDH SAE显示了高的内在过氧化物酶(POD)样催化活性，其性能是Ru纳米簇(NCs)纳米酶的20倍，并进一步考察对O2·、·OH、NO·和DPPH·的清除能力以及在细胞内的抗氧化活性。
6、方法和技术手段
SEM、TEM、XPS、XRD、FT-IR、UV-vis、DFT、Fluorescence microscopy
7、主要研究成果
1、LDH的平均粒径约为40 nm，合成的Ru1/LDH与MgAl-LDH在形态上没有明显的差异，也没有发现Ru NCs。HRTEM图显示晶格间距为0.23 nm，对应于MgAl-LDH的(015)晶面。在高角环形暗场扫描透射电子显微镜下观察到，Ru1/LDH中明显的单个亮点(红圈突出显示)为原子分散的单个Ru原子。相应的元素映射显示了Mg、Al和Ru在LDH支架上的均匀分布，表明Ru原子均匀地分散在整个结构上。电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-AES)测定Ru在Ru1/LDH中的质量负载为1.05 wt.%。进一步将Ru的负荷量增加到2.80 wt.%，形成了尺寸约为1.2 nm的Ru NCs。动态光散射(DLS)证实LDH、Ru1/LDH和Ru NCs/LDH的平均粒径约为40 nm， LDH、Ru1/LDH和Ru NCs/LDH的ζ电位均为正。在Ru1/LDH和Ru NCs/LDH的x射线衍射(XRD)图中，观察到一组属于MgAl-LDH (JPCDS No. 70-2151)的峰，但没有分配给Ru的信号，这可以归因于Ru1/LDH和Ru NCs/LDH中的低Ru负载。
2、Ru1/LDH的Ru Kedge x射线吸收近边结构(XANES)光谱显示Ru原子的价态在+3 ~ +4之间，其吸收边略高于RuCl3，低于RuO2。Ru NCs/LDH的吸收边略高于Ru箔，但远低于RuCl3，表明Ru NCs/LDH中Ru原子的价态接近于0。Ru1/LDH的傅里叶变换扩展x射线吸收精细结构(FT-EXAFS)在1.3 Å处呈现主峰，对应于Ru-O配位。在2.4 Å (Ru-Ru散射路径)处没有出现明显的峰，说明Ru是原子分散的。相反，Ru NCs/LDH在2.4 Å处有一个主导峰，与Ru-Ru配位相对应。然后进行最小二乘EXAFS拟合，得到Ru位点的详细原子结构。最佳拟合结果表明，Ru1/LDH中的Ru原子与3个O原子配位， Ru NCs/LDH中的Ru原子是与LDH载体的O原子连接的12个配位金属Ru。还进行了小波变换(WT)分析，因为它可以分离后向散射原子，并在Ru原子的R和k空间提供更高的分辨率。Ru1/LDH的最大强度位于5 Å-1，这是由于Ru-O配位。同时进行了x射线光子光谱(XPS)分析。在Ru1/LDH的Ru 3p光谱中，463.6 eV处有一个优势峰，可以归因于Ru(III)，与XANES结果一致。此外，在Ru NCs/LDH中观察到一个属于Ru(0)的主导峰，表明Ru NCs/LDH中Ru的金属性质。Ru NCs/LDH中另外一个小的Ru(III)峰可能是由于Ru NCs/LDH中底层的Ru原子与LDH载体的O原子连接，增加了Ru价。
3、研究了Ru1/LDH的POD样活性。一种类似pod的酶可以在酸性介质中催化H2O2分解成O*。生成的O*与3,3 '，5,5 ' -四甲基联苯胺(TMB)进一步反应生成蓝色氧化TMB (oxTMB)，在652nm处显示出最大吸光度。在反应溶液中加入LDH后，属于oxTMB的信号没有明显变化，说明纯LDH的pod样活性较差。而加入Ru1/LDH后，信号急剧升高，且明显高于Ru NCs/LDH，说明Ru1/LDH具有更强的POD样活性。我们进一步根据米氏动力学研究了通过添加不同浓度的底物来确定Ru1/LDH的POD-样活性的参数。通过测量反应曲线的初始线性范围的斜率来确定初始速度。通过将计算的初始速度(V)对底物浓度作图，产生米氏曲线。为了揭示活性Ru位点的真实浓度，我们使用CO脉冲化学吸附来探测实际暴露的活性位点。结果显示，Ru1/LDH和Ru NCs LDH中暴露的Ru位点浓度分别为0.60 wt%和0.89 wt%。催化反应速度在低底物浓度下线性增加，在较高底物浓度下达到平稳状态。使用H2O2作为底物时，Ru1/LDH显示出比Ru NCs/LDH(kcat/Km = 0.81×103S-1M-1)高约20倍的催化效率(kcat/Km = 1.69×104 S -1M-1)。当使用TMB作为底物时，Ru1/LDH还实现了更高的亲和力(Km = 0.121 mM)和催化效率(kcat/Km = 1.93×104 S -1M-1)，证明了Ru1/LDH优异的内在POD-样活性。更重要的是，Ru1/LDH可以连续快速地去除过量的H2O2，同时在5分钟内氧化TMB，持续5个循环，证明了其高稳定性。
4、为了进一步了解Ru1/LDH的高内在类POD-催化活性，用密度泛函理论研究了Ru1/LDH上H2O2氧化反应的途径。Ru1/LDH的模型是通过将单个Ru原子锚定在具有三个O原子的LDH的表面上而构建的。为了比较，考虑到32个Ru原子的尺寸(1.2 nm)与制备的Ru NCs的平均尺寸一致，构建了LDH表面上的32个Ru原子簇的模型来表示Ru NCs/LDH。DFT结果表明Ru1/LDH和Ru NCs/LDH表面均可发生H2O2分子的自发解离过程。然而，H2O2会通过异裂途径在Ru1/LDH的单一Ru位点上解离成O*中间体和H2O分子。相比之下，H2O2将通过均裂途径在Ru NCs/LDH的Ru NC位点上解离成两个OH*基团。H2O2在单原子Ru和Ru NC上如此不同的分解行为可以归因于单原子Ru和Ru NC之间原子结构和前线分子轨道取向的差异。Bader电荷分析表明，与三个O原子成键的Ru单原子比Ru NC显示出更高的化合价，在叠层中从Ru到相邻O原子有0.9个电子转移。因此，Ru1/LDH中的Ru位点有利于形成更多缺电子的O*中间体，而不是OH*。此外，Ru1/LDH的最高占据分子轨道(HOMO )与H2O2的最低未占据分子轨道(LUMO )对称不匹配，导致H2O2在Ru1/LDH上的异裂路径解离。相比之下，Ru NCs/LDH的HOMO可以与H2O2的LUMO很好地匹配，导致H2O2的HOMO裂解路径解离。还计算了相应的类POD-反应的自由能分布，以提供对催化机理的深入理解。H2O2在Ru1/LDH和Ru NCs/LDH上的吸附和解离是高度放热的，自由能分别为4.62 eV和4.95 eV。然而，随后的氢化和解吸过程是吸热过程，具有上坡自由能路径，自由能分别为0.43 eV和0.63 eV，这意味着Ru1/LDH更有利于反应。上述理论研究清楚地支持Ru1/LDH比Ru NCs/LDH具有更高的类POD酶活性。
5、SAE对多种活性氧和氮(ron)的清除能力也是其实际应用的重要因素。除H2O2外，还考察了Ru1/LDH对O2·、·OH、NO·和DPPH·的清除能力。O2·是另一种ROS，可以通过自突变或其他类型的反应转化为有毒的H2O2。为了维持细胞中的氧化还原平衡，多种酶，如SOD和CAT，可以共同作用，保护细胞免受氧化损伤。然后，我们通过抑制硝基蓝四氮唑(NBT)的光还原来检测Ru1/LDH清除O2·(类SOD活性)的能力。在紫外线照射下，核黄素、蛋氨酸和NBT存在时，观察到560nm的强吸光度，提示O2·-的存在。一旦Ru1/LDH存在，信号显著减弱，表明O2·被Ru1/LDH有效清除。与LDH或Ru NCs/LDH相比，Ru1/LDH在560 nm处吸光度最低，表明其对O2·的清除活性最高。此外，随着Ru1/LDH浓度的增加，清除能力增强。结果表明，Ru1/LDH通过催化O2·歧化生成H2O2和O2，具有优异的类SOD活性。值得注意的是，O2·-消除过程中新生成的H2O2可以通过Ru1/LDH两种途径进一步分解为O* (POD)或O2 (CAT)，这取决于pH值。如上所示，Ru1/LDH在酸性介质中表现出高的POD样活性。因此，通过监测240 nm处H2O2的吸光度，进一步评估碱性培养基中Ru1/LDH的CAT活性。在Ru1/LDH存在的情况下，在240 nm处观察到明显的还原和清晰的气泡，表明H2O2分解。随着Ru1/LDH浓度的增加，催化能力增强。上述结果表明，Ru1/LDH也可以作为CAT类酶在碱性溶液中有效清除H2O2。在细胞代谢中，通常由类芬顿反应诱导的H2O2产生的高活性·OH会显著加剧氧化损伤。我们通过使用对苯二甲酸(TA)测定法进一步评估了Ru1/LDH的·OH清除活性。TA与·OH反应形成2-羟基对苯二甲酸(TAOH)，其在440 nm处显示荧光发射。当加入Ru1/LDH或Ru NCs/LDH时，信号显著降低，表明H2O2分解原位产生的·OH被淬灭。此外，清除能力随着Ru1/LDH的增加而增强。显然，Ru1/LDH的降低的信号强度远大于Ru NCs/LDH和LDH，表明其对·OH.具有更好的清除活性。此外，我们还评估了Ru1/LDH的NO·清除活性。一氧化氮(NO·)是一种以氮为中心的自由基(NCR)，在正常情况下发挥重要的生理作用，在疾病期间过量产生并诱导氧化应激。在此，NO·由硝普钠(SNP)在生理pH 7.4下产生，并通过Griess试剂反应定量。Griess试剂与NO·转化为亚硝酸盐反应后，在510 nm处表现出较强的吸收。在LDH、Ru NCs/LDH或Ru1/LDH存在时，吸收减弱，说明部分NO·被纳米酶清除。与NC/LDH和LDH相比，Ru1/LDH的吸收率最低，表明其清除活性最高。此外，Ru1/LDH的清除能力随其浓度的增加而增强。在正常情况下，NO·是生物系统中重要的信号分子，因此，当·OH水平较高而NO·处于正常状态时，由于Ru1/LDH SAE对·OH的清除能力比NO·高得多，我们可以通过调节Ru1/LDH SAE的量，在不显著影响正常NO·水平的情况下实现·OH的清除。DPPH·(1,1-二苯基-2-吡啶肼基自由基)是另一种稳定的NCR，其清除能力已被广泛研究。Ru1/LDH清除DPPH·的活性通过对空白517 nm处的吸光度监测来评估。一旦加入Ru1/LDH，属于DPPH·的信号消失，说明DPPH·被Ru1/LDH有效清除。与LDH或Ru NCs/LDH相比，Ru1/LDH对DPPH·的清除活性最高。吸光度值随着Ru1/LDH浓度的增加而降低，其表观颜色变化也证明了这一点。此外，Ru1/LDH可以重复使用，连续清除DPPH·，显示其清除活性的可持续性。
6、鉴于Ru1/LDH SAE具有较高的自由基清除活性和生物安全性，我们下一步研究了Ru1/LDH在细胞内的抗氧化活性。采用2′，7′-二氯荧光素(DCFH-DA)作为荧光探针检测细胞内ROS水平。RAW264.7在Rosup刺激下12 h观察到高荧光信号。添加LDH或Ru1/LDH后，荧光强度下降。值得注意的是，对于Ru1/LDH，荧光信号明显减弱，流式细胞术定量分析表明，近83%的ROS可被有效消除。为了进一步证明Ru1/LDH SAE的稳定性，我们测试了Ru1/LDH在RAW264.7细胞中清除自由基的时间依赖性活性。随着时间延长至24 h和48 h, LDH和Ru1/LDH对细胞内ROS均表现出持续的清除活性，且细胞内ROS清除率随着时间的增加而逐渐增加。当时间延长至48 h时，Ru1/LDH仍能清除97%的ROS，表明其在此条件下具有较高的稳定性。以上结果表明Ru1/LDH能够有效且持续地清除细胞内ROS。此外，纳米酶的生物相容性对细胞内应用也很重要。在RAW264.7细胞中加入Ru1/LDH或LDH, 37℃孵育12 h后，细胞活力未见明显变化，说明Ru1/LDH具有良好的生物相容性和生物安全性。
8、作者给出结论
1、开发了一种多功能模拟酶Ru SAE，Ru1/LDH SAE在清除H2O2方面表现出高的POD酶活性，这是由于与Ru NC上的均裂途径相比，在Ru的高价位上，其H2O2解离的自由能较低。
2、Ru1/LDH还具有模拟多酶的能力，可以有效地清除O2·、H2O2，并快速清除·OH、NO·和DPPH·。
3、Ru1/LDH可以有效清除近97%的细胞内ROS，保护细胞免受氧化应激。
转自：“科研一席话”微信公众号
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