导读
芪甲柔肝汤（QJ）由八味中草药和两种动物药组成，是一种具有保肝、抗纤维化作用的有效中药。然而，其潜在的行动机制仍不清楚。本研究旨在探讨中药复方制剂治疗大鼠肝纤维化的作用机制。我们用四氯化碳（CCl4）构建大鼠肝纤维化模型，并对纤维化大鼠灌胃QJ；用苏木精、伊红和Masson三色染色法评估肝脏病理变化。本研究采用定量蛋白质组学方法对QJ中的差异表达蛋白（DEPs）进行分析。随后，我们使用蛋白质印迹法验证了QJ处理后改善肝纤维化的潜在机制。结果发现，QJ显著改善肝功能，减轻纤维化进展。基于串联质量标签（TMT）蛋白质组学，我们在QJ与模型和模型与对照之间鉴定了818种共同的DEPs，包括296种上调和522种下调的DEPs。这些DEPs主要参与代谢途径、氧化还原反应和胶原生物合成过程。此外，我们发现QJ通过抑制胱天蛋白酶蛋白的表达、抑制促凋亡蛋白和促进抗凋亡蛋白来减少肝细胞死亡。我们进一步证明QJ抑制Akt/mTOR通路。结论：QJ通过多途径调节CCl4诱导的大鼠肝保护作用。本研究提供了QJ治疗肝纤维化的蛋白质信息。
图文摘要
论文ID
原名：TMT-based proteomics analysis identifies the interventional mechanisms of Qijia Rougan decoction in improving hepatic fibrosis
译名：基于TMT的蛋白质组学分析确定芪甲柔肝汤改善肝纤维化的干预机制
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.4
发表时间：2023.10
通讯作者：Wu Peijie和于瀚
通讯作者单位：成都中医药大学基础医学院
实验设计
实验结果
1. 芪甲柔肝汤对大鼠肝损伤及肝纤维化的改善作用
在我们之前的研究中，我们使用HPLC-MS/MS分析对来自QJ的化合物进行了评估。简言之，通过匹配mzCloud数据库识别出1028个成分，超过400个成分的得分>60。其中，熊果酸、丹参酮IIA、异甘草素、刺芒柄花素、18-β-甘草次酸、隐丹参酮、大豆黄酮和烟酸8种主要成分的mzCloud最佳匹配得分>95。令人惊讶的是，这些成分中的大多数已被证明可以抑制肝星状细胞（HSC）活化，抑制炎症反应，改善氧化应激，并表现出抗纤维化作用。这些结果表明，QJ可能在肝纤维化中发挥抗纤维化作用。
表1 QJ的成分
为了检测QJ对肝损伤和肝纤维化的保护作用，在前8周，SD大鼠用CCl4进行处理，构建肝纤维化大鼠模型，然后用QJ或PC药物治疗7周。H&E和Masson染色表明，与对照组相比，CCl4处理的大鼠肝脏表现出显著的肝细胞水肿、肝索排列紊乱、纤维结缔组织增生、炎症细胞浸润和肝小叶结构破坏（图2A-2C）。相反，QJ和PC药物恢复了肝脏结构的完整性，并减少了胶原纤维的积累（图2A-2C）。我们测量了血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和总胆红素（TBIL）的水平，因为它们间接反映了肝功能的状态。实验数据显示，CCl4处理后显著提高了ALT、AST和TBIL水平，而QJ和PC药物显著降低了这些生化指标（图2D-2F）。此外，我们还检测了血清层粘连蛋白（LN）、III型胶原蛋白（PC III）和透明质酸（HA）的水平。令人惊讶的是，我们在CCl4处理组中观察到血清LN、PC III和HA水平的显著上调，这些水平在QJ和PC药物治疗后显著下调（图2G-2I）。此外，我们检测了纤维化基因（Col1a1、Col3a1、Col4a1、Acta2、Timp1、Timp2、Timp3、Pdgfra）的mRNA水平。我们发现CCl4增加了这些纤维化基因的表达，而芪甲柔肝汤逆转了这些基因的增加（图3）。总之，这些结果表明QJ有效地减轻了纤维化损伤。
图1 TMT定量蛋白质组学分析实验流程图
2. 基于TMT的蛋白质鉴定和定量
为了全面评估QJ处理引起的肝脏蛋白质变化，我们进行了基于TMT的定量蛋白质组学实验。主成分分析（PCA）显示，来自同一组的样本聚类良好，而来自不同组的样本明显分离（补充图1A）。总体而言，我们鉴定了290278（89118个匹配）谱，其中43824个鉴定的肽（38791个独特肽）和5638个定量的蛋白质（补充图1B）。蛋白质的质量控制验证如补充图1C–1F所示。如补充图1C所示，超过96.1%的肽质量偏差<8ppm，这表明仪器处于良好状态。此外，大多数肽的获得离子分数均>20（补充图1D）。大多数肽的分子量在10至100kDa之间（补充图1E）。大多数肽的长度在6至19个氨基酸之间（补充图1F）。这些结果表明，基于TMT的蛋白质组学数据是高质量和可靠的。。
图2 QJ减轻CCl4诱导的大鼠肝纤维化损伤。（A）大鼠肝脏H&E染色的代表性图像（比例尺= 100 μm）；（B）大鼠肝脏Masson三色染色（比例尺= 100 μm）的代表性图像；（C）四组（n = 7-14）肝纤维化的量化；（D-I）大鼠血清生化指标（n ≥ 8）；（D）ALT；（E） AST；（F）TBIL；（G）LN；（H）PC III；（I）HA。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
3. 差异表达蛋白(DEPs)分析
如上所述，我们鉴定了5638种蛋白质。根据1.2倍表达变化和p值小于0.05的标准筛选DEPs。我们在模型组与对照组的比较中确定了2021个DEPs（1486个上调，535个下调），在QJ和模型组之间有924个DEPs（360个上调，564个下调），QJ组和对照组之间有601个DEPs（482个上调，119个下调）（图4A；表2）。亚细胞定位分析表明，大多数DEP分布在胞质溶胶、细胞核、细胞外间隙、线粒体和质膜中（图4B）。
表2 组间差异表达的蛋白质
QJ：芪甲柔肝汤组；DEPs：差异表达的蛋白质。
图3 QJ可减弱纤维化基因的表达。qRT-PCR分析大鼠（n=6）中Col1a1、Col3a1、Col4a1、Acta2、Timp1、Timp2、Timp3和Pdgfra的mRNA水平。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
4. QJ差异表达蛋白的功能分析
本研究旨在探讨QJ在肝纤维化中的潜在作用机制。我们集中研究了QJ与模型和模型与对照之间的共同DEP，即模型与对照和QJ与模式中的重叠蛋白质。上调的共同DEP在模型组中下调，但在QJ组中上调。相反，下调的共同DEP在模型组中上调，但在QJ组中逆转。如图5A和E所示，我们鉴定出296个上调和522个下调的共同DEPs。使用层次聚类对三组中共同DEP的表达模式进行聚类（图5B和F）。进行GO和KEGG富集分析以进一步阐明它们的作用。GO分析结果表明，上调的共同DEP参与了各种生物过程，如外源代谢、氧化还原和氨基酸分解代谢（图5C）。此外，下调的共同DEPs主要参与内质网到高尔基体囊泡介导的转运、逆行囊泡介导的运输、高尔基体到内质网、高尔基组织和胶原生物合成过程（图5G）。在分子水平上，上调的共同DEPs参与血红素结合、氧结合和胆汁酸跨膜转运蛋白活性（图5C），而下调的共同DEP参与7S RNA结合、信号识别颗粒结合和琥珀酰辅酶A水解酶活性（图5G）。细胞成分中上调的共同DEP的丰富GO项包括线粒体基质、内质网膜和膜的整体成分，而细胞成分中下调的共同DEPs的重要GO途径包括顺式高尔基体网络、内质网腔和黑素体（图5C和G）。KEGG分析表明，上调的共同DEP主要参与代谢途径、氨基酸代谢（色氨酸、支链氨基酸等）和次级代谢产物的生物合成（图5D）。同时，显著下调的共同DEP与内质网中的蛋白质加工、蛋白质输出和囊泡运输过程中的SNARE相互作用密切相关（图5H）。此外，共同DEP上调或下调的前20种蛋白质列于补充表3中。
图4 基于TMT的肝脏蛋白质组定量分析。（A） 火山图显示了比较组中上调（红色）和下调（绿色）的蛋白质，NS，不显著；（B）比较组之间DEP重叠的亚细胞定位分析。
5. QJ的机制研究及关键蛋白验证
我们验证了蛋白质组学结果，并阐明了QJ在肝纤维化中作用的分子机制。正如我们在HE染色中观察到的那样，QJ改善了细胞死亡。因此，我们研究了QJ在肝细胞死亡中的作用。TUNEL染色表明CCl4导致严重的肝细胞凋亡，而QJ处理显著减少了细胞凋亡（图6A）。免疫印迹结果表明，CCl4处理后凋亡胱天蛋白酶-3上调，而QJ处理降低了其表达（图6B）。此外，促凋亡蛋白Bax在CCl4暴露后增加，而在QJ处理后减少，而抗凋亡蛋白Bcl-xL在CCl4处理后弱表达，在QJ治疗后高表达（图6B）。这些发现表明QJ抑制CCl4诱导的肝细胞死亡。
图5 QJ与模型和模型与对照之间共同DEP的功能分析。（A）上调的共同DEP；（B）上调的共同DEP的聚类分析；（C）上调的共同DEP的GO分析；（D）上调的共同DEP的KEGG富集分析；（E）下调的共同DEP；（F）下调的共同DEP的聚类分析；（G）下调的共同DEP的GO分析；（H）下调的共同DEP的KEGG富集分析。
此外，mTOR信号通路已被报道参与肝纤维化，这也在我们的蛋白质组学分析中被检测到（图5H）。如图7所示，与对照组相比，CCl4处理显著提高了磷酸化Akt和mTOR蛋白的水平，而QJ显著降低了磷酸化Akt和mTOR蛋白质的表达。这些发现表明QJ抑制Akt/mTOR信号级联。
图6 QJ抑制肝细胞凋亡。（A） TUNEL染色检测肝细胞凋亡（比例尺= 100μm）；（B）进行蛋白质印迹以评估大鼠肝脏中凋亡相关蛋白的水平（左），图像显示了定量结果（右，n = 4）。*P＜0.05，***P＜0.001。
图7 QJ抑制Akt/mTOR信号转导通路。进行蛋白质印迹以监测大鼠肝脏中Akt/mTOR蛋白的表达（左），图像显示了定量结果（右，n = 4）。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
讨论
在本研究中，我们确定QJ是一种对病理性肝纤维化具有保护作用的中药配方。QJ显著减轻了肝纤维化的发展，血清生化指标显著改善，维持了肝脏结构的完整性，减少了炎症细胞浸润，减少了胶原过度沉积。随后，我们使用基于TMT的定量蛋白质组学分析来探索全局蛋白质变化和QJ治疗的潜在机制。我们使用TMT蛋白质组学在QJ与模型和模型与对照之间鉴定了818个共同的DEP。这些蛋白质参与内质网内的代谢、次级代谢产物代谢和蛋白质加工。从机制上讲，我们发现QJ可以调节肝细胞死亡和Akt/mTOR信号通路。这些结果表明QJ在肝纤维化中具有保肝作用。
QJ是一个有效的护肝中药处方，含有10种中草药，1000多种成分。据报道，黄芪和甘草是QJ的主要药材，它们可以通过减轻肠道微生物组紊乱和改善肠道屏障障碍来减轻3，5-二乙氧羰基-1，4-二氢吡啶对肝脏的损伤。另一种草药丹参及其活性成分具有抗纤维化、抗炎、抗氧化和抗细胞凋亡的作用，这表明丹参对肝脏疾病的治疗前景广阔。同时，当归、中华鳖、桃均具有保肝作用。此外，QJ的许多活性成分，包括黄芪总苷、甘草酸和隐丹参酮，都能抑制肝纤维化的发展。例如，据报道，从黄芪中分离的黄芪总苷通过降低蛋白酶激活的受体-2的表达或抑制Notch信号转导途径发挥抗纤维化作用。甘草的主要成分甘草酸，已被发现通过调节TGF-β1/Smads信号转导途径、抑制肝细胞凋亡和减少活化的HSC数量来预防药物治疗的肝纤维化。因此，QJ的显著协同抗纤维化作用可能取决于整个QJ草药及其活性成分。
蛋白质组学分析可以反映全局蛋白质谱的变化，并广泛用于检测各种疾病的分子机制、生物标志物和治疗靶点。在此，我们进行了基于TMT的蛋白质组学分析，以探讨QJ在肝纤维化中的潜在机制。分析显示818个重叠的DEPs可能受到QJ的调节。这些结果表明，QJ的74个下调的DEP靶点在细胞外空间富集。例如，胎球蛋白A/alpha2HS糖蛋白，一种含有胶原的细胞外基质，与肝纤维化密切相关，可能受到QJ的调节。ECM在肝脏中的过度积聚是由ECM的产生和降解失衡引起的肝纤维化的标志。ECM的主要成分是胶原蛋白，GO分析表明参与了由共同DEP富集的胶原蛋白生物合成过程。此外，氧化应激调节肝脏特异性细胞的正常功能，并在肝纤维化的进展中发挥重要作用。抑制氧化应激是一种很有前景的延缓纤维化进展的策略。对共同DEP的GO分析也表明细胞对氧化应激反应的调节。越来越多的证据表明，支链氨基酸（BCAAs），包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，在慢性肝病中不仅是蛋白质成分，而且是药理学营养素。研究表明，补充BCAA可以通过减少氧化应激或炎症反应来改善肝纤维化啮齿动物的组织病理学变化。对上调的共同DEP的GO和KEGG分析也显示了对BCAA代谢的调节。因此，蛋白质组学分析是评估QJ在肝纤维化中作用的分子机制的有力工具。
各种肝脏疾病总是伴随着肝细胞死亡，如细胞凋亡和细胞焦亡。细胞凋亡是指程序性细胞死亡，其特征是细胞发生形态学和生化变化，以有效清除受损细胞，而细胞焦亡涉及炎症小体引发的胱天蛋白酶-1和其他胱天蛋白酶4/5/11介导的炎症细胞死亡。几项研究表明，肝细胞凋亡导致肝脏炎症反应、HSC激活和肝纤维化进展，肝细胞细胞焦亡释放NLRP3炎症小体颗粒，激活HSC并促进肝纤维化。半胱天冬酶是一个进化上保守的半胱氨酸依赖性天冬氨酸特异性蛋白酶家族，由凋亡和炎症半胱天冬蛋白酶组成。凋亡胱天蛋白酶包括启动子（胱天蛋白酶2/8/9/10）和效应子（胱天蛋白酶3/6/7）胱天蛋白酶，而炎症性胱天蛋白酶主要包括胱天蛋白酶1、-4、-5、-11和-12。各种促凋亡刺激启动胱天蛋白酶级联反应，进一步激活启动子和效应子胱天蛋白酶以触发细胞凋亡。促凋亡蛋白BCL-2-相关的X（Bax）和抗凋亡蛋白BCL-xL与凋亡途径密切相关。抑制细胞凋亡和细胞焦亡诱导的肝细胞死亡对肝脏疾病具有治疗意义。在我们的研究中，我们检测到肝纤维化中凋亡胱天蛋白酶3的增加，而QJ组则有所减少。模型组中Bax和Bcl-xL蛋白分别上调和下调，QJ治疗可逆转这一现象。总之，这些结果表明，QJ可以通过抑制肝细胞死亡来保护肝脏免受纤维化损伤。
结论
总之，芪甲柔肝汤是一种有效的改善肝纤维化的中药方剂。这可能归因于其抑制肝细胞死亡和Akt/mTOR信号通路的作用。我们的研究为研究QJ的抗纤维化作用提供了新的方向。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378874123012047#appsec1
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