导读
多囊卵巢综合征（PCOS）是一种高度流行的内分泌和代谢紊乱，与卵巢颗粒细胞（GC）的增殖和凋亡密切相关。中药白蔹（AJ）是植物白蔹的干燥块茎根，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、伤口愈合和抗肿瘤的特性；然而，目前尚不清楚这种草药是否对多囊卵巢综合征有治疗作用。因此，本研究旨在探讨AJ对多囊卵巢综合征的药理作用，揭示其潜在的作用机制。我们用来曲唑建立PCOS大鼠模型。建立PCOS模型后，大鼠口服AJ和Diane-35（阳性药物：炔雌醇+环丙孕酮片）处理2周。脂质组学采用液相质谱法和色谱法进行。AJ显著调节PCOS大鼠血清激素水平并减弱卵巢的病理变异。此外，AJ显著降低卵巢GC的凋亡率。脂质组学分析显示，AJ调节由脂蛋白脂酶（Lpl）、二酰甘油胆碱磷酸转移酶（Chpt1）和胆碱/乙醇胺磷酸转移酶类（Cept1）介导的甘油和甘油磷脂代谢途径。因此，我们确定AJ可以通过调节脂质代谢来减少卵巢GC的凋亡，最终改善PCOS的排卵功能障碍。本研究证明，AJ是治疗多囊卵巢综合征的新候选者。
研究热点：
1. 白蔹减轻了多囊卵巢综合征患者的症状并改变了血清激素水平；
2. 白蔹通过减少颗粒细胞凋亡来改善卵巢状态；
3. 白蔹调节甘油和甘油磷脂代谢途径；
4. 白蔹是一种很有前景的治疗多囊卵巢综合征的新药。
论文ID
原名：Ampelopsis japonica aqueous extract improves ovulatory dysfunction in PCOS by modulating lipid metabolism
译名：白蔹水提物通过调节脂质代谢改善多囊卵巢综合征的排卵功能障碍
期刊：Biomedicine & Pharmacotherapy
IF：7.5
发表时间：2023.12
通讯作者：汤庆发，王启瑞
通讯作者单位：南方医科大学中医药学院
实验设计
实验结果
1. AJ的UPLC-MS/MS分析
基于Mz Cloud数据库(https://www.mzcloud.org/)和TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/)以及与文献资料的比较，AJ提取物的植物化学分析显示鉴定出31种化合物。我们在正离子模式下进行质谱分析，化合物的谱特征和详细信息见补充材料4。
图1 AJ对多囊卵巢综合征大鼠生殖系统的影响
（A）发情周期（P：前发情期；E：发情期；M：动情后期；D：发情间期）；（B）雌性大鼠发情周期的恢复；（C）体重；（D）卵巢重量；（E）子宫重量。结果表示为平均值±SD（n=6，与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；与PCOS组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
2. AJ改善多囊卵巢综合征大鼠的发情周期紊乱，减轻体重和卵巢质量
如图1A和B所示，正常大鼠组表现出规则的性激素循环，而80%的模型大鼠表现出紊乱的性激素周期，在AJ和Diane-35给药后，性激素循环得到不同程度的恢复。此外，多囊卵巢综合征组大鼠的体重明显高于正常组大鼠，而AJ组大鼠体重下降（图1C）。与正常组相比，PCOS大鼠卵巢重量显著增加，子宫重量显著下降。相反，AJ组的卵巢重量显著下降，子宫重量显著增加（图1D和E）。
图2 AJ对多囊卵巢综合征大鼠卵巢形态和性激素水平的影响
（A）不同实验组大鼠卵巢显微照片（HE×200）；（B）黄体数量；（C）卵泡数量；（D）17β-雌二醇（E2）水平；（E）促卵泡激素（FSH）水平；（F）促黄体生成激素（LH）水平；（G）睾酮（T）水平。结果表示为平均值±SD（n=6，与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；与PCOS组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
3. AJ减轻PCOS大鼠卵巢病理变异和血清激素水平变化
我们进行了H&E染色以确定大鼠卵巢组织的形态学结构（图2A）。我们在对照组观察到不同发育阶段卵泡及部分黄体；卵泡结构完整，包括卵母细胞、卵母细胞堆积和规则排列的GC。然而，我们发现多囊卵巢综合征组大鼠的卵巢中有少量黄体和大量结构异常的卵泡，囊性扩张，GC排列松散，层数减少，没有卵母细胞。AJ和Diane-35组显示卵巢结构恢复，包括囊性卵泡减少，GC增加和规则排列，结构完整的优势卵泡出现，黄体增加（图2B和C）。
我们在实验大鼠中测量E2、FSH、LH和T的血清水平（图2D–G）。PCOS患者的E2和FSH水平显著低于正常组，LH和T水平显著高于正常组。然而，AJ和Diane-35组的E2和FSH水平显著高于PCOS组，LH和T水平显著低于PCOS组。这些结果表明AJ和Diane-35均能纠正PCOS大鼠卵巢组织的形态学紊乱，恢复性激素水平失调。
图3 AJ对多囊卵巢综合征大鼠颗粒细胞凋亡的影响
通过TUNEL测定法测量的PCOS大鼠受损卵巢中颗粒细胞的凋亡率（n=3；条形图：50µm）。结果以平均值±SD表示，#与正常组比较，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001；*与PCOS组相比，P<0.05，***P<0.01，***P<0.001。
4. AJ抑制多囊卵巢综合征大鼠卵巢GC细胞凋亡
为了评价AJ对PCOS大鼠卵巢GC的影响，我们进行了TUNEL染色。如图3所示，PCOS组的细胞凋亡率明显高于对照组，而AJ组的细胞死亡率明显低于PCOS组。这表明AJ在卵巢GC凋亡中起着有益的作用。
图4 脂质亚群和脂质分子的数量
根据国际脂质分类和命名委员会并基于LipidSearch软件（4.1版）进行脂质亚组和脂质分子计数。
5. 鉴定的脂质化合物数量
LC-MS/MS用于非靶向脂质组学分析，随后使用LipidSearch 4.1进行数据处理。根据国际脂质分类规则，我们对本研究中检测到的脂质成分进行预处理，并根据脂质分子和亚类的数量进行计数（图4）。我们共鉴定出33个脂质亚类，546个脂质分子。
6. AJ治疗多囊卵巢综合征大鼠的脂质代谢组学研究
我们开发了PCA、PLS-DA和OPLS-DA模型，以观察每组样品中检测到的脂质的组间分离趋势。首先，在含有QC样品的PCA中，QC样品紧密地聚集在组的中间，表明测定样品具有良好的再现性（图5A）。大鼠血清样本的PCA评分图显示，正常组和PCOS组的样本明显分离，而正常组和AJ组的散点图部分重叠（图5B）。在PLS-DA和OPLS-DA模型中，来自三个大鼠组的样品彼此分离，并且来自每组的样品被很好地聚类（图5C和E）。PLS-DA和OPLS-DA（n=200）的置换检验表明，所建立模型的质量具有高可靠性（图5D和F）。这些结果表明PCOS组大鼠的脂质代谢异常，AJ可能显示出治疗效果。
我们使用PLS-DA模型来筛选潜在的生物标志物，其特征是投影变量重要性（VIP）≥1、倍数变化（FC）≥1.2或≤0.83和t检验P值<0.05这三个条件，并通过火山图进行可视化。与多囊卵巢综合征组相比，正常组有25种上调脂质和36种下调脂质（图5G）。此外，与AJ组相比，PCOS组中有86种脂质上调，47种脂质下调（图5H）。我们还通过聚类分析了差异代谢物（图5I和J）。
图5 AJ治疗多囊卵巢综合征大鼠的脂质代谢组学研究
多元统计分析（A：所有样本和QC样本的PCA评分图。B：正常组、PCOS组和AJ组的PCA得分图；C：正常组和PCOS组的PLS-DA评分图。D：正常组、PCOS组、AJ组PLS-DA置换检验。E：正常组与PCOS组、AJ组OPLS-DA评分图。F：正常组及PCOS组与AJ组OP LS-DA置换检验。）G：正常组与多囊卵巢综合征组的代谢产物火山图；H：PCOS组与AJ组的代谢产物火山图。火山代谢物图；蓝点表示下调的差异代谢产物，红点表示上调的差异代谢物，灰点表示差异代谢产物但无显著差异。I：正常组与多囊卵巢综合征组的分层聚类热图。J：PCOS组与AJ组的分层聚类热图。差异代谢物的分级聚类热图，变化程度标记为红色（上调）和蓝色（下调）。
7. 交叉脂质成分
我们从正常组与PCOS组和PCOS组与AJ组共筛选出33种交叉的差异脂质（图6A）。AJ给药能够逆转这33种脂质，属于甘油三酯（TG）、磷脂酰胆碱（PC）、二甘油酯（DG）、磷脂基乙醇胺（PE）、溶血磷脂酰肌醇（LPI）和胆固醇酯（ChE）（图6B）。表1列出了这33种脂质的详细信息。为了进一步分析正常组、PCOS组和AJ组中这33种不同代谢物的变化，我们比较了它们的相对强度（潜在脂质代谢物的相对峰面积占各自谱总积分面积的百分比）（图6C）。
表1 代谢组学分析中显著差异代谢物的鉴定
图6 差异代谢产物的分析
（A）正常组与多囊卵巢综合征（PCOS）组以及PCOS与AJ组的血脂差异维恩图。（B）正常组与PCOS组以及PCOS与AJ组的交叉差异脂质类别。（C）正常组与PCOS组和PCOS与AJ组交叉差异脂质的峰值强度。结果以平均值±SD表示，与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；与PCOS组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
8. 生物途径分析
为了进一步探索AJ可能影响的关键代谢途径，我们进行了基于交叉差异脂质的途径富集分析。确定了相关的代谢途径，基于MetaboAnalyst的结果(http://www.metaboanalyst.ca/)，并将联合效应和P值用作潜在关键代谢途径的筛选指标（图7A，表2）。最后的关键途径是甘油和甘油磷脂代谢（图7B）。
基于富集途径的结果和代谢产物的差异，我们鉴定了潜在的调节脂质代谢产物的基因，包括脂蛋白脂酶（Lpl）、二酰甘油胆碱磷酸转移酶（Chpt1）和胆碱/乙醇胺磷酸转移酶。卵巢组织荧光定量PCR显示，PCOS组Lpl、Chpt1和Cept1的相对表达水平与正常组相比显著降低，而AJ组与PCOS组相比有显著增加（图7C）。
表2 已鉴定的不同脂质种类的脂质代谢途径分析
图7 AJ治疗多囊卵巢综合征大鼠代谢途径的分析和验证
（A）已鉴定的不同脂质种类的脂质代谢途径分析。使用MetaboAnalyst进行路径分析。（每个圆圈的颜色和大小基于路径影响值，因为气泡的大小与路径的重要性成比例）。（B）AJ对PCOS大鼠甘油脂质代谢和甘油磷脂代谢途径的调节（绿色箭头表示PCOS组与正常组相比的上调或下调。红色箭头表示AJ组与PCOS组相比的下调或上调）。（C）卵巢组织中Lpl、Chpt1和Cept1基因表达的RT-qPCR分析。结果表示为平均值±SD（n=6，与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；与PCOS组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。
讨论
在本研究中，我们基于抑制卵巢GC中雄激素向雌激素转化的原理，使用芳香化酶抑制剂建模方法建立了多囊卵巢综合征大鼠模型，使用最常见的芳香酶抑制剂来曲唑导致雄激素在卵巢中过多积聚。高雄激素血症中的发情周期和卵巢组织形态学的变化与多囊卵巢综合征的临床症状一致。AJ是白蔹的干燥块茎根。对与AJ同属的其他植物的研究发现，显齿蛇葡萄可以改善糖脂代谢，缓解2型糖尿病。蛇葡萄（葡萄科）浆果可通过产生活性氧来降低乙醇对肝细胞的损伤程度。因此，我们评估了AJ对多囊卵巢综合征代谢和生殖特征的潜在影响。我们发现AJ减轻了PCOS引起的激素和排卵异常，包括降低血清T和LH水平、囊性扩张卵泡和闭锁卵泡数量，增加E2和FSH水平、黄体和优势卵泡数量。
越来越多的研究发现，卵巢中GC的过度凋亡会导致卵泡发育异常，导致排卵障碍和不孕。我们发现PCOS组GC的凋亡率显著高于正常对照组，这与先前的研究一致。AJ在给药后14d抑制卵巢GC凋亡并改善卵泡质量。考虑到AJ提取物的植物化学分析结果，我们观察到的药理作用的潜在贡献者包括原儿茶酸、白藜芦醇、没食子酸和槲皮苷。原儿茶酸和白藜芦醇已被证明可以改善卵巢GC细胞凋亡，减轻多囊卵巢综合征的症状。此外，没食子酸和槲皮苷可能对多囊卵巢综合征有积极的治疗作用，因为它们分别通过调节脂联素和PI3K/Akt来改善脂肪细胞分解代谢，从而纠正生殖和代谢异常。脂质代谢显著影响GC的增殖。Fuchs等人显示了甘油磷脂的组成，特别是醚键合的甘油磷脂和二酰基甘油磷脂与细胞凋亡之间的显著关联。因此，我们研究了AJ减轻PCOS卵巢GC细胞凋亡的具体机制，重点是脂质代谢。
血清脂质组学显示多囊卵巢综合征模型大鼠的脂质代谢有相当大的紊乱。PCOS模型大鼠共有61种脂质代谢产物受到影响，AJ对其中33种脂质具有“逆转作用”。PCOS大鼠的TG和DG水平上调，但AJ给药后恢复到正常水平。TG和DG水平升高与各种疾病的风险增加有关，包括肥胖、胰岛素抵抗、糖尿病、心血管疾病和多囊卵巢综合征。此外，细胞中TG浓度升高会对巨噬细胞产生脂毒性作用，导致脂毒性细胞凋亡。DG水平已被报道为胰岛素抵抗的预测指标，我们应进一步研究以阐明其在多囊卵巢综合征发病和进展中的作用。此外，DG在细胞中的积累引起脂毒性和内质网应激，导致细胞凋亡。PC是细胞膜的主要组成部分，与生物体的生长密切相关。为了阐明潜在的脂质分子机制，我们分析了富集的代谢途径；甘油代谢和甘油磷脂代谢被确定为涉及交叉差异脂质种类的主要途径。随后，我们测定了卵巢组织中与甘油酯代谢和甘油磷脂代谢信号通路相关的基因的mRNA表达水平。AJ上调Lpl、Chpt1和Cept1的mRNA表达。Lpl表达的上调已被证明可能导致脂质氧化和降解，并优化脂质代谢以减轻大鼠的肥胖。Chpt1和Cept1是参与合成PC和PE的Kennedy途径最终反应的关键酶。Chpt1和Cept1的基因失活可直接导致磷脂合成减少。Chpt1和Cept1对PC和PE的从头合成贡献相等，并且这两种酶都促进细胞增殖。
几项研究表明，脂质代谢水平异常，特别是甘油和甘油磷脂代谢产物，可能会导致内质网应激。在Cryptomeria hydradii线虫中，甘油磷脂的变化，如PC含量的减少，会影响IRE-1的表达，导致未折叠的蛋白质反应ER。一些研究表明ER应激与细胞凋亡诱导有关；因此，深入研究可以为更全面地研究细胞凋亡机制提供重要见解。细胞内ER应激可能导致多囊卵巢综合征患者卵巢GC凋亡增加。甘油和甘油磷脂代谢异常有助于卵巢GC的凋亡。总之，AJ通过调节甘油和甘油磷脂代谢来减弱卵巢GC凋亡，从而对多囊卵巢综合征的排卵失调发挥有益作用。
结论
总之，我们评估了AJ在多囊卵巢综合征大鼠模型中的药理作用和机制。AJ具有恢复生殖内分泌环境平衡、纠正脂质代谢紊乱和改善排卵障碍的治疗潜力。AJ的药理作用可能归因于几个关键成分，即原儿茶酸、白藜芦醇、没食子酸和槲皮苷。AJ的治疗机制可能涉及通过调节由Lpl、Chpt1和Cept1等靶点介导的甘油磷脂和甘油磷脂的代谢途径来减少ER应激，其进一步减少卵巢GC的凋亡并最终改善PCOS中的排卵功能障碍。因此，AJ可能是治疗多囊卵巢综合征的新候选者。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38159378/
转自：“如沐风科研”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
