细胞焦亡（pyroptosis）又称细胞炎性坏死，是近年来新发现的程序性细胞死亡，主要表现形式是细胞肿胀至细胞膜破裂，然后引出细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。
与细胞凋亡和细胞坏死不同，细胞焦亡是是依赖Gasdermin蛋白家族质膜打孔引发的新型细胞炎性程序性死亡。其核心是gasdermin介导，目前研究显示Caspase-1、Gasdermin D 、IL-1β和 NLRP3等蛋白在细胞焦亡中发挥重要作用。
细胞焦亡在机体免疫防御中发挥重要作用：一方面细胞焦亡会引发机体强烈炎症应答，辅助机体消灭入侵病原微生物；另一方面细胞焦亡的过度激活会引发机体炎性因子风暴，导致致命炎性疾病如脓毒症等。近年来，细胞焦亡正在成为固有免疫领域和肿瘤免疫治疗领域研究热点之一。
线粒体是细胞死亡、分化、增殖及免疫反应的中心枢纽。既往研究报道Gasdermin D (GSDMD)介导的细胞焦亡早期伴随线粒体损伤的发生，但其具体分子机理和作用机制尚未可知。
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近日，中国科学院上海免疫与感染研究所刘星研究员，联合美国哈佛大学Judy Lieberman教授、同济大学张鹏教授团队在Immunity上发表了题为Gasdermin D permeabilization of mitochondrial inner and outer membranes accelerates and enhances pyroptosis的封面文章。
该研究首次突破性的揭示了GSDMD介导线粒体损伤的分子机制，并进一步阐明了其在细胞焦亡信号放大及增强机体抗感染/抗肿瘤免疫应答过程中的关键作用。
为了探索线粒体在细胞焦亡中的作用，研究者对经LPS+nigericin焦亡诱导处理的THP-1细胞（人单核细胞白血病细胞）进行了线粒体完整性和膜电位评估（PI+或SYTOX+指示死细胞，MTDR或TMRM检测线粒体膜电位，MTG染线粒体），结果发现，在焦亡过程中线粒体的膜电位下降，线粒体失去极化。
对仅采用nigericin诱导焦亡的THP-1细胞进行透射电镜观察（TEM），研究者发现，在触发细胞焦亡后，线粒体发生形态学改变，变得圆缩并受到了严重破坏（黑色箭头正常线粒体，红色箭头损伤的线粒体，黄色箭头线粒体脊丢失）。
接下来，研究者分析了经nigericin处理的THP-1培养液及线粒体和细胞膜部分的caspase-1、GSDMD和IL-1β活性端、N末端成孔的GSDMD片段(GSDMD-NT)与线粒体的结合以及细胞膜释放和分泌的线粒体内容物（细胞色素c、基质ACO2和mtDNA）。
结果发现，诱导焦亡后，胞浆内caspase-1增加，切割GSDMD，全长GSDMD-FL减少，GSDMD-NT增加；线粒体多个组分（IL-1β、细胞色素c、ACO2）都是先出现在胞浆，再进入培养基，这些数据表明，GSDMD-NT可在细胞质膜破坏之前使线粒体膜通透。
接下来，研究进一步评估了经LPS+nigericin处理的THP-1的线粒体膜电位（TMRM强度）、细胞ROS生成（DCFDA强度）和质膜通透性（SYTOX Green吸收）。结果发现，在细胞吸收SYTOX Green之前，DCFDA上升，TMRM下降，证明线粒体功能障碍先于细胞死亡。
线粒体在焦亡过程中扮演什么角色呢？
于是，研究者用溴化乙锭（EB）处理小鼠骨髓巨噬细胞（iBMDMs）构建线粒体缺失的ρ°细胞。
通过CellTiter-Glo检测发现，该ρ°细胞对经典（LPS+nigericin）和非经典的（LPS）焦亡激活因素介导的细胞焦亡均具有抗性，表明线粒体在细胞焦亡中起到关键作用，线粒体缺失会抑制细胞焦亡发生。
接下来，为了初步阐明线粒体介导焦亡的机制，研究者首先对已知的线粒体ROS会放大焦亡作用，进行验证。
研究者通过MitoTEMPO（利用MitoTEMPO清除线粒体ROS）处理的iBMDMs，结果发现，中和线粒体ROS后，细胞死亡（以SYTOX green摄取指示细胞死亡）受限，再次暗示线粒体在焦亡过程中扮演重要角色。
此外，研究者还使用了一个化学遗传系统，通过表达酵母D-氨基酸氧化酶（DAAO），标记核输出或定位序列和对H2O2敏感的比率计荧光生物传感器HyPer7，对细胞内的氧化还原状态进行局部操纵。结果发现，向细胞质表达HyPer7-DAAO的细胞中添加D-丙氨酸（而不是L-丙氨酸）会增加细胞质H2O2和焦亡。相反，在核表达HyPer7-DAAO的iBMDM中，D-丙氨酸不会增强焦亡。这表明，细胞质ROS会放大焦亡。
诱导焦亡后，线粒体发生损伤，线粒体对于焦亡至关重要，焦亡是如何影响的线粒体呢？
一个潜在的可能是GSDMD N端“打洞”线粒体。为了确定GSDMD-NT是否与线粒体结合并介导线粒体功能障碍，研究者构建了GSDMD-NT-BFP蓝色荧光融合蛋白。
经多西环素(DOX)处理后，表达GSDMD-NT-BFP的细胞中，线粒体ROS升高（MitoSOX），然后线粒体膜电位降低（TMRM），线粒体逐渐减少，最后细胞膜通透（吸收染料PI、SYTOX DR，指示细胞死亡）。而表达FL-GSDMD-BFP的细胞中线粒体染料强度和PI吸收无变化。
GSDMD-NT-BFP至少在质膜通透前50分钟与线粒体染料定位，证实了GSDMD-NT早期靶向线粒体。
为了证实GSDMD-NT与线粒体的共定位，研究者在HEK293T细胞中表达了flag标记的GSDMD-FL或-NT，证实了GSDMD-NT在细胞质膜定位之前会在线粒体上共定位。
GSDMD-NT到线粒体，暗示可能到线粒体“打洞”。为了确定GSDMD-NT是否会结合并破坏线粒体膜，研究者用重组GSDMD和caspase-11蛋白处理分离的线粒体，以生成活性GSDMD-NT。
通过对释放的线粒体蛋白进行免疫印迹分析发现，可溶性线粒体基质蛋白（ACO2）和IMS蛋白（细胞色素c和HtrA2）在加入caspase-11和GSDMD后5分钟内从线粒体中释放出来，但不包括与膜结合的COXIV。
当线粒体与GSDMD和caspase-11共同孵育时，mtDNA也被释放，但单独或与t-Bid共同孵育时则没有释放。
通过MitoSOX Red和DiIC1染色法，GSDMD和caspase-11处理分离的线粒体也分别显著增加了ROS和降低了膜电位。
这些结果表明，GSDMD-NT可直接渗透OMM和IMM，而无需其他因素。
为了证实GSDMD-NT孔在线粒体膜损伤中的作用，研究者在加入GSDMD和caspase-11之前先将分离的线粒体与DSF预孵育（单纯抑制GSDMD打孔），结果发现，DSF阻止了线粒体释放细胞色素c和mtDNA，暗示焦亡过程GSDMD-NT孔能使线粒体通透，损伤线粒体。
那么，GSDMD-NT如何到线粒体呢？
由于GSDMD-NT与心磷脂具有很高的亲和力，而线粒体膜不含其他已知的与GSDMD-NT结合的脂质，因此研究者假设线粒体损伤取决于线粒体心磷脂。
心磷脂由心磷脂合酶（Crls1）合成，并由磷脂加扰酶-3（Plscr3）外化至外膜（OMM），为了研究OMM心磷脂是否为GSDMD-NT介导的线粒体损伤所必需，研究者在iBMDMs细胞中对Crls1和Plscr3进行了基因敲除。
在经LPS+nigericin处理的Crls1-/-和Plscr3-/-iBMDMs中，GSDMD-NT没有被招募到线粒体，线粒体完整性和膜电位、线粒体数量和平均长度以及受损线粒体百分比几乎恢复到未经焦亡诱导的WT iBMDMs中的水平。此外，线粒体ROS以及细胞色素c和mtDNA的胞浆释放也被阻断。
同样，用GSDMD和caspase-11处理Crls1-/-和Plscr3-/-iBMDM的分离线粒体也不会释放细胞色素c、HtrA2或mtDNA。
这些数据表明OMM心磷脂介导了GSDMD依赖性线粒体损伤。
为了研究线粒体损伤在体内的免疫作用，研究者在敲除了J774细胞(小鼠巨噬细胞肿瘤细胞系)中的Piscr3，结果发现，与对照相比，在Plscr3-/- J774细胞中，LPS+nigericin刺激的焦亡显著减少。
为了评估线粒体损伤在焦亡性免疫原性细胞死亡(ICD)中的重要性，研究者将LPS+nigericin或细胞毒性药物丝裂霉素C (MMC)处理的对照或Piscr3-/- J774与WT J774混合，并皮下注射到小鼠体内。
暴露于nigericin处理的Plscr3-/- J774的肿瘤生长速度快于暴露于nigericin处理的WT J774的肿瘤生长速度，而MMC处理的J774细胞中的Plscr3缺陷并不影响肿瘤生长。这些数据表明，线粒体损伤促进细胞焦亡诱导体内抗肿瘤免疫。
心磷脂主要在线粒体内膜（IMM）上，但需要在OMM上才能与细胞质中的GSDMD-NT发生反应，导致线粒体损伤。研究者推测，GSDMD-NT可通过与暴露出心磷脂的少数线粒体结合来启动线粒体损伤，但随着线粒体损伤的发生，更多的线粒体会迅速暴露出心磷脂。
为了验证这一观点，研究者首先用抗心磷脂染色法检测了从未经处理的细胞中分离出来的线粒体是否暴露了心磷脂，发现一些线粒体暴露了心磷脂，使其可以被GSDMD-NT所接近。
用活性GSDMD-NT处理离体线粒体时，心磷脂外暴露显著增加。线粒体氧化剂、抗霉素A、鱼藤酮或4-(三氟甲氧基)苯基腙（FCCP）诱导的线粒体ROS也增加了心磷脂的暴露量。这些结果表明，GSDMD-NT和线粒体ROS（由GSDMD-NT触发）增加了心磷脂暴露，这可能会扩大GSDMD结合和线粒体损伤。
在细胞凋亡过程中，线粒体外膜通透（MOMP）会释放核酸外切酶PNPT1，启动全局mRNA降解，从而促进细胞凋亡。由于焦亡也会触发MOMP，因此PNPT1很可能也会释放到细胞膜，并在焦亡过程中触发mRNA降解。
为了验证这一观点，研究者通过免疫荧光显微镜和免疫印迹法分析了PNPT1在LPS-和LPS+nigericin处理的iBMDM中的定位情况。
在LPS诱导的细胞中，PNPT1定位于线粒体，但加入nigericin后则移至细胞质，PNPT1在Plscr3-/-和Crls1-/-iBMDM中释放受阻。分别在Plscr3-/-和Crls1-/-iBMDMs中异位表达WT PLSCR3和CRLS1，可恢复由nigericin或沙门氏菌诱导的焦亡mRNA衰减。
因此，OMM心肌磷脂是PNPT1诱导的焦亡mRNA降解所必需的。
为了研究PNPT1介导的mRNA降解是否有助于焦亡，用nigericin、LPS转染或沙门氏菌处理WT和Pnpt1-/-iBMDM。结果表明Pnpt1缺乏会明显减轻焦亡，但不会影响nigericin诱导的PNPT1释放包括caspase-1和GSDMD的裂解、GSDMD的寡聚化和与线粒体和质膜的结合，或线粒体形态变化、ROS或mtDNA释放。
为了证实PNPT1 RNase活性对促进焦亡至关重要，在Pnpt1-/- iBMDMs中表达了WT或RNase缺失的PNPT1。异位WT而非RNase缺失的PNPT1可挽救nigericin诱导的焦亡，这表明PNPT1介导的mRNA衰变促进了焦亡。
总结
综上，该研究首次阐释了细胞焦亡早期GSDMD诱导线粒体损伤的关键分子机制及其在细胞焦亡过程中的关键“不可逆转性”与“信号放大”功能。
该研究揭示了一种新型由Gasdermin成孔蛋白介导的线粒体细胞死亡通路，为病原体感染及肿瘤等相关疾病的预防/治疗提供了新的思路与靶点。
转自：“如沐风科研”微信公众号
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