导读
本研究将代谢组学技术与网络药理学相结合，以确定关键代谢产物和关键基因。本研究旨在通过代谢组学研究芪白平肺胶囊（QBPF）治疗慢性阻塞性肺病（COPD）的作用机制。我们在对照组和模型组的大鼠肺组织中鉴定了96种不同的代谢产物，其中47种被确定为关键代谢产物（变量投影重要性(VIP) >2，p<0.05）。此外，QBPF处理后，16种重要的差异代谢产物被逆转。利用网络药理学，我们确定了81种药物活性成分中的176个核心靶点。我们对网络药理学和代谢组学的全面分析使我们能够确定一个核心靶点，前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2），以及一个核心代谢途径-谷胱甘肽代谢。最后，分子对接结果表明，PTGS2对富马碱、山柰酚等18种化合物具有较强的结合活性。PTGS2是铁死亡的标志物，因此我们想探索QBPF是否能抑制COPD的铁死亡。结果表明，铁死亡参与了COPD的发病机制，QBPF可抑制铁死亡的发生。总之，QBPF治疗COPD的机制可能与PTGS2的表达、谷胱甘肽代谢和铁死亡有关。
论文ID
原名：Integration of metabolomics and network pharmacology to reveal the protective mechanism underlying Qibai Pingfei capsule on chronic obstructive pulmonary disease
译名：结合代谢组学和网络药理学揭示芪白平肺胶囊对慢性阻塞性肺疾病的保护机制
期刊：Frontiers in Pharmacology
IF：5.6
发表时间：2023.10
通讯作者：朱洁
通讯作者单位：安徽中医药大学
实验设计
实验结果
1. 代谢组学分析
1.1 多元分析
首先，我们使用主成分（PCA）散点图来描述模型组和对照组的离散趋势（图2A）。模型组和对照组明显不同。之后，我们使用正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）评分比较模型组和对照组之间与COPD相关的差异代谢产物（图2B）。COPD大鼠的代谢谱发生了显著改变。最后，我们使用置换检验来评估数据和模型之间的拟合程度以及模型的预测效果（图2C）。模型组与对照组的R2X (cum)、R2Y (cum)、Q2 (cum)、R2截距和Q2截距分别为0.692、0.991、0.86、0.922和- 0.499。R2>0.5表明模型的拟合程度较好；Q2>0.5表明该模型的预测效果较好，Q2截距小于0表明该模型是有效的。然后，正常组和模型组的火山图（图2D）表明差异代谢物被很好地分离。总之，模型各方面的数据对下一步的筛选都是有效的。
表1 本研究中使用的引物
图1 代谢组学和网络药理学分析的工作流程
我们采用独立样本t检验的VIP值和p值筛选差异代谢产物，在模型组和对照组之间总共比较了96种差异表达的代谢物。基于VIP>2和p<0.05，我们进一步筛选出47种显著差异代谢产物（表2），这些代谢产物被视为后续实验的潜在差异代谢产物。为了更好地分析这些潜在的差异代谢物，我们对96种差异代谢物和47种潜在的生物标志物进行了聚类分析，热图如图2E、F所示。
表2 47种显著差异代谢物的信息
CON和MOD之间存在差异（*p＜0.05，**p＜0.01）。
图2 COPD大鼠肺组织代谢特征的多元统计分析
（A）PCA评分图。（B）OPLS-DA评分图。（C）交叉验证的结果。（D）火山图。（E）对照组和模型组差异代谢产物热图。（F）与正常组相比，VIP>2的差异代谢产物的热图。
1.2 QBPF对潜在生物标志物的影响
我们在第42天采集肺组织，并进行主成分分析（图3A）。在各组中，相对明显的聚类显著分布在不同的位置。QBPF处理组的位置接近对照组，表明QBPF可以改善COPD大鼠模型中的异常代谢网络。在QBPF处理后，我们研究了QBPF对COPD大鼠模型中潜在生物标志物的调节作用。在潜在的47种生物标志物中，QBPF影响了16种潜在的生物标志物，包括L-乙酰肉碱、Cysteineglutathione disulfide、6-酮-前列腺素F1a、氧化型谷胱甘肽、曲二糖、谷胱甘肽、D-麦芽糖、Caproic acid、缬酸、S-乳酰谷胱甘肽、甲基十六烷酸、4-ene-Valproic acid、gamma-Glutamylglycine、Prenol、前列腺素A2和11-cis-Retinol。我们绘制了16种潜在生物标志物的散点图（图4）。
图3 QBPF对潜在生物标志物的影响
（A）各组PCA评分图。（B）代谢途径参与COPD的发病机制。（C）QBPF治疗下COPD大鼠的代谢途径。
图4 潜在生物标志物的散点图
1.3 代谢路径分析
差异代谢产物的代谢途径分析可以有效地检测代谢产物对疾病的影响。我们将标志物导入MetaboAnalyst 5.0中进行代谢途径分析，如图3B、C和补充材料S1所示。我们使用p＜0.05的筛选条件发现，与正常组相比，模型组中显著改变的生物标志物主要参与谷胱甘肽代谢、鞘脂代谢和甘油磷脂代谢。相反，QBPF影响的回调生物标志物主要与谷胱甘肽代谢有关，表明QBPF主要通过调节谷胱甘肽代谢来改善COPD。
图5 （A）GSE76925火山图。（B）COPD、QBPF和GSE76925之间交叉靶点的维恩图。（C）QBPF治疗COPD的PPI网络。（D）cytohubba中Betweenness算法计算出的前10个基因。（E）cytohubba中由BottleNeck算法计算的前10个基因。（F）cytohubba中通过stress算法计算出的前10个基因。
2. 网络药理学
2.1 通过网络药理学识别潜在靶点
我们采用OB>30%和DL>0.18的特异性筛选标准，从TCMSP数据库和地龙（蚯蚓）文章中获得了81种QBPF的活性成分，用Pubchem和SwissTargetPrediction数据库获得这81种活性成分的相应靶点，在重复数据消除后获得1149个靶点。我们从OMIM、Genecards、TTD和DisGeNET数据库中确定了6874个COPD候选靶点，以进一步完善COPD治疗靶点的选择。为了提高我们靶点的准确性，我们从GEO数据库下载了数据集GSE76925，其中包含对111例COPD病例和40名对照吸烟者肺组织的全基因组分析。通过应用|log2FC|>0和p<0.05的筛选标准，我们鉴定出8220个COPD差异表达基因（补充材料S2）（图5A）。使用VENNY2.1.0软件，我们比较并交叉了三个来源的结果（图5B），获得了249个QBPF治疗COPD的潜在靶点。
图6 GO和KEGG富集分析
（A）BP富集分析。（B）CC富集分析。（C）MF富集分析。（D）KEGG富集分析。
2.2 相互作用网络的PPI构建与核心基因筛选
利用STRING数据库(https://cn.string-db.org/)，我们对249个潜在靶点和网络构建置信度得分>0.9的选定靶点进行了PPI网络分析（图5C）。我们的结果显示网络中涉及248个节点和406个边。随后，我们将176个候选靶点导入Cytoscape3.8.2，以开发蛋白质相互作用网络的可视图。为了确定前10个基因，我们在Cytoscape内的Cytohubba插件中使用了Betweenness（图5D）、BottleNeck（图5E）和stress（图5F）算法。最后，通过将三种算法的结果进行交叉，确定了六个关键基因，包括HSP90AA1、EGFR、SIRT1、RELA、STAT3和PTGS2。
图7 化合物富马碱、山柰酚、FA、Jaranol、Erysimoside、Gomisin R和鸟苷与PTGS2的分子对接图
2.3 GO和KEGG富集分析
我们使用Metascape平台对176个关键靶标进行了KEGG途径和GO富集研究(https://metascape.org/)。GO富集分析包括生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞成分（CC）。GO富集研究的最高20个结果如图6A–C所示。同时，KEGG富集的前20个途径如图6D所示。
2.4 分子对接
根据网络药理学的筛选结果，我们鉴定出25种可以靶向PTGS2的有效化合物。对接结果表明，18种化合物对PTGS2（补充材料S3）具有较强的结合活性。因此，我们选择了结合活性最低的前7种化合物与PTGS2进行分子对接，如图7所示。其中，富马碱与PTGS2的结合最强（−9.4 kcal/mol），其次是山柰酚（−9 kcal/mol）。
图8 （A）关键代谢产物和靶点的化合物-反应-基因网络。黄色椭球是差异反应。蓝色菱形是差异代谢产物。红色矩形是差异基因。（B）筛选PTGS2的维恩图。
3. 网络药理学与代谢组学的结合分析
代谢组学分析显示，QBPF处理组中存在16种生物标志物。其中，有6种生物标志物上调，而10种生物标志物下调。通路富集分析表明，这些生物标志物主要参与谷胱甘肽代谢。此外，我们的网络药理学研究还表明，预测的QBPF靶点的KEGG富集分析表明其具有调节谷胱甘肽代谢的潜力。这两项分析的共同发现表明，谷胱甘肽代谢是QBPF治疗COPD的核心途径。
此外，我们使用MetaboAnalyst 5.0中的网络分析功能对回调生物标志物进行了关联预测分析，获得了155个预测靶点。结果表明，这些回调的生物标志物主要聚集在三个网络中（补充材料S4）。随后，我们使用Cytoscape建立了靶点代谢途径PPI网络，如图8A所示。此外，我们使用MetaboAnalyst 5.0预测生物标志物的相关基因，对cytohubba筛选的关键基因进行交叉分析，PTGS2被确定为QBPF调控的最关键基因（图8B）。
图9 COPD大鼠肺功能结果及肺病理特点
（A–C）肺功能显示所有组的FEV 0.3、FVC和（FEV 0.3/FVC）%。（D）肺损伤评分。（E–G）各组的肺部病理特征（比例尺=200μm）。[CON和MOD之间存在差异（*p＜0.05，**p＜0.01）。MOD与QBPF比较有显著性差异（##p<0.01）]。
4. 动物实验
4.1 肺功能
COPD的主要特征是气道阻塞，这是肺功能测试的一个特征。与正常组相比，模型组大鼠的0.3秒用力呼气容积（FEV0.3/mL）、FEV0.3/FVC%和用力肺活量（FVC/mL）显著降低（p<0.05），表明QBPF处理后大鼠的肺功能显著改善（图9A-C）。
4.2 H&E染色
正常组大鼠肺泡结构未见明显损伤（图9E）。内皮细胞排列正常，管壁每层均有少量炎症细胞。在模型组中，我们观察到肺泡结构的破坏和融合、管腔中的渗出物、管壁中的炎性细胞浸润和管腔狭窄（图9F）。处理组的肺部病变有所改善。肺泡损伤减轻，管壁每层均发现少量炎症细胞（图9G）。并且，我们制作了大鼠肺组织损伤程度的评分表，以直观地评估三组大鼠的肺损伤（图9D）。
4.3 透射电镜显示
铁死亡作为一种新兴的细胞死亡方法，具有独特的病理变化。线粒体是铁的主要作用位点，铁过载会导致功能障碍和结构变化。铁死亡细胞的线粒体通常表现出线粒体嵴断裂甚至消失以及线粒体肿胀现象。我们的电子显微镜结果显示，对照组的线粒体呈颗粒状，形状和大小正常，线粒体嵴清晰可见。模型组线粒体嵴明显断裂消失，线粒体肿胀。QBPF处理后，这种现象有所改善（图10）。
图10 不同组肺组织的代表性TEM图像显示线粒体形态
模型组线粒体嵴明显断裂消失，线粒体肿胀。QBPF处理后，这种现象有所改善。
4.4 关键靶点与铁死亡的验证
为了确定COPD是否发生铁死亡贫血，以及QBPF是否能改善铁死亡肺病。我们评估了铁死亡的指标，包括脂质过氧化产物丙二醛（MDA）、乳酸脱氢酶（LDH）、Fe2+和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）。结果显示，COPD模型组肺组织中MDA、LDH和Fe2+含量增加，QBPF处理后这些指标水平下降（图11A–C）。WB和PCR结果显示，COPD大鼠肺组织中GPX4的表达降低，QBPF处理后GPX4表达增加（图11D、F、G）。上述结果表明，铁死亡参与了COPD的发病机制，QBPF可抑制COPD的铁死亡。WB和PCR显示COPD大鼠PTGS2的表达增加，QBPF处理后PTGS2表达降低，这与其他研究人员的实验结果相同（图E–F和H）。
图11 关键靶点和铁死亡的验证
（A–C）与正常组相比，模型组MDA、LDH和Fe2+含量增加，QBPF处理后恢复。（D，E）通过qRT-PCR在mRNA水平上表达GPX4和PTGS2。（F–H）WB检测GPX4和PTGS2在蛋白质水平上表达。[CON与MOD比较有显著性差异（**p＜0.01）。MOD与QBPF比较有显著性差异（#p<0.01）。CON和QBPF之间存在差异（+p＜0.05，++p＜0.01）。
讨论
慢性阻塞性肺病是一种严重且无法治愈的慢性肺病，给个人和社会带来了巨大负担。它的许多并发症，如肺动脉高压、骨质疏松和糖尿病，对其治疗提出了挑战。目前，姑息治疗仍然是COPD治疗的主要方法，因为没有高效的治疗方法。由于中药具有优越的治疗效果和较低的药物毒性，研究人员对其进行了探索。中药复方由多种中草药组成，具有治疗疾病的多靶点特点。QBPF作为一种有效治疗COPD的中药复方制剂，在临床治疗中具有独特的优势。因此，探索QBPF潜在的多靶点机制是本研究的重点。
由于中草药成分复杂，使用单一的代谢组学技术对其进行彻底检查可能不可行。因此，我们结合代谢组学和网络药理学来分析QBPF对COPD的治疗机制。我们的代谢组学研究结果表明，COPD大鼠中有96种不同的代谢产物发生了改变，其中47种VIP>2，并被鉴定为生物标志物。通路富集显示COPD主要与甘油磷脂代谢、鞘脂代谢和谷胱甘肽代谢异常有关。
QBPF处理回调了谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、11-cis-retinol、d-麦芽糖和S-乳酰谷胱甘肽等16种生物标志物。代谢途径的富集结果表明，QBPF治疗COPD的主要作用是由谷胱甘肽代谢调节的。谷胱甘肽（GSH）是一种丰富的三肽分子，可保护细胞免受氧化应激诱导的细胞损伤和脂质过氧化诱导的铁死亡。在GPX4催化下，GSH还原过氧化氢和脂质过氧化物，从而将自身氧化为氧化型谷胱甘肽（GSSG），保护细胞免受脂质过氧化物损伤。以GSH为核心的Xc-/GGSH/GPX4系统通路被认为是铁死亡的关键轴。在本研究中，COPD大鼠的GSH含量显著降低。但是，QBPF治疗后，其含量再次增加，这与其他研究的结果一致。因此，QBPF可能通过增加GSH含量来对抗脂质过氧化损伤从而治疗COPD。
与其他实验结果不同，我们的研究显示，模型组的GSSG降低，QBPF处理后略有逆转。然而，与正常组相比，模型组的GSH与GSSG的比例有所下降。随后，QBPF处理后，该比例增加，这与其他研究人员的结果一致（补充材料S5）。因此，我们推测GSSG的异常表现可能与相关的酶活性有关。
我们的网络药理学研究确定了81种活性QBPF成分及其176个COPD治疗靶点。此外，使用三种cytohubba算法，HSP90AA1、EGFR、SIRT1、RELA、STAT3和PTGS2被鉴定为hub基因。KEGG结果表明，这些预测靶点也参与了谷胱甘肽代谢通路（rno00480），这与我们的代谢组学结果一致，并证明QBPF通过调节谷胱甘肽代谢来治疗COPD。
为了进一步研究QBPF通过谷胱甘肽代谢治疗COPD的疗效，我们检查了代谢组学部分获得的生物标志物相关基因与网络药理学中鉴定的八个核心基因的交叉点。最后，我们确定PTGS2是调节谷胱甘肽代谢的QBPF的核心靶点。通过分子对接确定，山柰酚等活性成分与PTGS2具有良好的对接能力。
编码PTGS2的基因，也称为环氧合酶2（COX-2），位于1号染色体上。PTGS2是合成前列腺素（PG）的限速酶，催化花生四烯酸（AA）代谢为各种PG产物，包括前体前列腺素H2（PGH2）和白三烯（LT）。PTGS2在肺部疾病中起着重要作用。在急性肺损伤中，NLRP3炎症小体的影响可以通过抑制PTGS2的表达来减轻。类似地，PTGS2参与COPD的炎症，COPD是一种慢性炎症性疾病。研究表明，CS促进PTGS2的表达，从而诱导COPD的炎症。ROS作为PTGS2的必需转录因子，可促进其表达。GSH可有效抑制COPD患者ROS的产生，从而减轻氧化应激和铁死亡。
越来越多的证据表明，PTGS2也是一种铁死亡的标志物。研究表明，CS可诱导COPD大鼠上皮细胞铁死亡，加重COPD的炎症损伤。抑制PTGS2可以减少COPD支气管上皮细胞铁死亡的发生，从而改善气道重塑。因此，我们假设QBPF可能介导PTGS2调节铁死亡并发挥抗炎作用。
为了验证QBPF是否能调节COPD的铁死亡，我们构建了COPD大鼠模型，并检测了铁死亡的相关指标。生化检测结果显示，COPD大鼠肺组织MDA、LDH和Fe2+含量相较于正常大鼠显著升高，QBPF处理后MDA、LDH、Fe2+含量下降。WB和PCR显示QBPF可促进铁死亡生物标志物GPX4的表达，降低PTGS2的表达。上述结果表明，COPD大鼠肺组织中存在铁死亡，QBPF可抑制COPD大鼠铁死亡的发生。然而，QBPF对COPD的具体调节作用仍需我们的后续实验验证。
结论
在我们的研究中，代谢组学成分确定了COPD大鼠谷胱甘肽代谢、鞘脂代谢和甘油磷脂代谢的异常变化。QBPF能够通过调节谷胱甘肽（核心代谢产物）代谢来治疗COPD。网络药理学的预测结果也证实谷胱甘肽代谢是QBPF治疗的有效途径。结合代谢组学和网络药理学的结果，我们确定PTGS2是QBPF通过调节谷胱甘肽代谢治疗COPD的核心靶点。同样，我们的分子对接结果表明，铁死亡、山柰酚、FA、Jaranol、Erysimoside、Gomisin R和鸟苷与PTGS2对接良好。最后，我们预测QBPF可能通过调节PTGS2和谷胱甘肽来抑制COPD铁死亡。进一步的后续实验将验证确切的机制。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37920214/
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