英文原题：An Ion-Pair Induced Intermediate Complex Captured in Class D Carbapenemase Reveals Chloride Ion as a Janus Effector Modulating Activity
通讯作者：Yuan He (和媛), Yi Jin (金轶)
作者：Qi Zhou（周琪), Pablo Catalán, Helen Bell, Patrick Baumann, Rebekah Cooke, Rhodri Evans, Jianhua Yang (杨建花), Zhen Zhang (张桢), Davide Zappalà, Ye Zhang (张烨), George Michael Blackburn, Yuan He (和媛)*, Yi Jin (金轶)*
背景介绍
抗生素耐药性是全球健康领域面临的重大挑战。以 OXA-48 为代表的 D 类碳青霉烯酶是临床细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因，但是抑制剂的缺乏使得产OXA-48酶耐药细菌成为了当前临床抗感染治疗的难点。西北大学和媛和曼彻斯特大学金轶团队合作，在前期报道 OXA-48 水解抗生素出现“双相动力学”（biphasic kinetics）的基础上（Angew Chem Int Ed, 2018,57 (52), 17120-17124. doi: 10.1002/anie.201810834），发现氯离子是 “双相动力学”的真正诱因，进一步揭示了氯离子调控碳青霉烯酶活性的分子机制，并探索了氯离子对耐药菌检测和抗菌治疗的影响。
文章亮点
1
利用等温滴定量热法（ITC）监测不同条件下OXA-48酶的反应全过程，发现氯、溴、碘离子等可以诱导酶分子在催化过程中失活。应用遗传密码拓展技术在蛋白中插入N -乙酰赖氨酸，证明催化失活与活性中心KCX脱羧无关，澄清了这个领域长期以来一个误解。
2
通过X射线单晶衍射、荧光光谱和动力学建模，提出氯离子是OXA-48的Janus双面效应物：既可以结合活性中心导致共价反应中间体错误取向抑制酶的活性，也可以结合酶的二聚体界面增强酶的活性，表现出“双相动力学”曲线。
3
氯离子诱导的“双相动力学”特征可用于特异性检测产OXA-48酶细菌。体外实验表明补充一定浓度的氯离子也可保活现有抗生素，增强其对产OXA-48酶细菌的抗菌活性。
图文解读
研究人员利用ITC监测了OXA-48酶的反应全过程，发现氯离子可以诱导OXA-48酶的催化失活，表现为“双相动力学”曲线。应用遗传密码拓展技术在蛋白中插入非天然氨基酸N -乙酰赖氨酸，制备了 OXA-48AcK73 突变蛋白，证明“双相动力学”中的失活作用与活性中心KCX73脱羧无关，解决了这个领域长期以来一个误解。作者进一步通过x射线晶体学技术，在OXA-48AcK73 -亚胺培南复合物结构中捕获到了一个前所未有的非活性中间体。在该结构中，一个卤素离子结合在活性中心R250基团附近，导致亚胺培南的酶酰化中间体翻转了180°，堵住了催化水分子的进出通道，从而使酶分子失活。荧光实验证明，氯离子可以干预OXA-48酶在反应过程中的构象变化。溶液实验进一步确认，R250残基是氯离子诱导OXA-48酶催化失活的作用位点。
图1 （a-c）氯离子诱导的“双向动力学”不是由KCX脱羧引起的。（d）亚胺培南与卤素离子竞争R250附近的结合位点。OXA-48AcK73 亚胺培南复合物结构中捕获到的（e）活性中间体，（f）非活性中间体和（f）二者共存的状态。（i，j）当卤素离子结合在活性中心R250基团附近，亚胺培南的酶酰化中间体翻转180°，堵住催化水分子的进出通道，从而使酶分子失活。
此外，研究人员还发现，氯离子与酶二聚体界面残基的结合可以通过变构效应激活OXA-48酶。基于上述实验证据和数学模拟，作者提出了一种在含氯溶液中OXA-48酶水解抗生素的新机制：氯离子既可以与活性位点的R250形成离子对，导致反应中间体取向错误而抑制酶的催化活性，也可以通过结合二聚体酶界面对酶进行变构活化。氯离子的Janus效应是酶在反应过程中出现“双相动力学”的原因，而且氯离子的这种调控作用广泛存在于OXA-48酶对亚胺培南、苯唑西林、青霉素G、头孢霉素等多种抗生素的水解过程中。
图2 含氯溶液中OXA-48酶水解抗生素的反应机制
最后，作者还探索了含氯溶液对耐药菌检测和抗菌治疗的潜在影响。研究结果显示，含氯溶液中的“双相动力学”是OXA-48类酶的显著特征，可用于特异性、快速地将产OXA-48酶的D类肠杆菌科细菌与A类、B类细菌进行区分。此外，体外实验中补充一定浓度的氯离子也可增敏抗生素对产OXA-48酶细菌的杀伤作用。
图3 氯离子对耐药菌检测和抗菌治疗的影响
总结与展望
该工作发现氯离子可结合碳青霉烯酶，干预抗生素水解过程，不仅拓展了我们对于离子影响酶活的认识，也为开发针对耐药菌的检测和治疗方法提供了新思路。因为氯化钠是机体重要的电解质，也是缓冲液、细菌培养液等的常见组分，该结果也提醒人们应该关注溶液中氯离子对实验结果及抗生素药效的潜在影响。
通讯作者信息
和媛，西北大学化学与材料科学学院教授、博导，陕西省“生物医用磁学纳米材料创新团队”骨干。2011年博士毕业于英国约克大学，2013年加入西北大学，2016年入选陕西省青年百人计划。主要从事酶结构-功能、 磁性杂化酶的构建及生物医学应用研究。主持国家自然科学基金和陕西省重点研发计划等多项科研项目。研究成果在包括JACS、 Angew. Chem. Int. Ed.、 ACS Catal、 ACS AMI、 Nanoscale 等国内外权威期刊发表文章40余篇，授权中国发明专利3件、软件著作权1件。
课题组主页：
http://faculty.nwu.edu.cn/YuanHe2/zh_CN/index.htm
金轶，英国曼彻斯特大学Manchester Institute of Biotechnology研究员，博士生导师，英国Wellcome Trust Sir Henry Dale Fellow。2012年博士毕业于英国谢菲尔德大学，2017年成为英国卡迪夫大学独立PI。2021年加入曼彻斯特大学，致力于细菌抗生素耐药性和癌症酶学研究，涉及有机合成、分子生物学、微生物学、大分子核磁共振和结构生物学等研究手段。迄今为止，共获得科研经费总额180万英镑，发表论文三十余篇，期刊包括Nat. Chem. Biol.、PNAS、Angew. Chem. Int. Ed.、ACS Catal.、ACS Cent. Sci.、Comm. Chem.、ChemComm、ChemBioChem等。
课题组主页：
https://www.research.manchester.ac.uk/portal/yi.jin.html
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
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