PBJ | 利用高通量测序等综合策略解析一个未授权的转基因小麦材料的遗传基础

2017年，在加拿大艾伯塔省南部发现了抗草甘膦小麦植株，这代表加拿大未经授权释放了转基因作物。由于大多数国家都没有授权转基因小麦进行商业化生产，抗草甘膦小麦植株的发现代表了加拿大未经授权的转基因释放。未经授权释放转基因生物通常会影响贸易和当地经济，因此需要及时对未知转基因小麦进行鉴定。

多种基于 PCR 的方法可用于表征和识别未知的转基因事件。这些方法可大致分为（1）特定于元素的方法（2）特定于构造的方法和（3）特定于事件的方法。然而这些方法都存在一定的局限性，因此需要开发新的植物转基因事件鉴定方案。近日，加拿大食品检验局的研究人员在Plant Biotechnology Journal上发表了题为“An integrated strategy involving high-throughput sequencing to characterize an unknown GM wheat event in Canada”的研究论文，他们以基因组步移和目标富集等靶向策略，结合高通量测序、Sanger测序来全面检测和鉴定未知或部分未知的转基因事件，对这一未知的、未经授权的转基因小麦事件进行了定性和鉴定，并开发了经过验证的诊断测试。

研究人员首先通过PCR和Sanger测序筛选未知的转基因小麦样品的转基因元件，获得了用于几种转基因小麦生产的元件包括p35S、RactInt1等。扩增产物提供了转基因元件的方向、序列顺序和构造体中元件拷贝数的信息。

图1.用于描述和识别未知转基因小麦事件的策略流程图。

研究人员使用鉴定的转基因元件引物结合简并引物库进行五轮基因组步移，表征邻近的遗传元件并确定转基因元件中的转基因插入位点。并且通过目标富集策略与基因组步移策略并行实施，以识别转基因5'和3'连接处的元件和序列。结果发现并没有检测到T-DNA以及抗生素抗性基因，表明转化通过基因枪轰击而非农杆菌进行。研究人员利用 Illumina MiSeq配对末端读取，使研究能够完善插入序列并预测功能性 CP4-EPSPS 蛋白。

基于基于检测到的不同转基因元件的存在、它们的顺序以及生物射弹轰击的转化 ，利用从孟山都收到的两个事件特异性 PCR 方案，检测到未知小麦为MON71200阳性，为孟山都公司开发的抗草甘膦转基因小麦品系。

图二 根据Sanger测序和高通量测序数据重建的MON71200转基因的遗传图谱。

研究人员设计了结构特异性和事件特异性qPCR测定。结构特异性鉴定围绕Ractlnt1/CP4-EPSPS连接点和CP4-EPSPS/tNOS连接点设计，以提高特异性；事件特异性qPCR检测能够实现对 MON71200事件的特异性检测。此外，研究人员对诊断分析进行优化，对引物/探针浓度以及退火温度选择，改善了结构特异性测定的qPCR扩增，对MIX的选择也对qPCR有一定影响。对未知转基因小麦检测限和交叉反应性进行验证分析，两种检测方法具有准确性，能够特异性的鉴定出未知转基因小麦。

研究人员使用了综合方法鉴定了加拿大未知且未经授权的转基因小麦事件，并开发了结构特异性和事件特异性 qPCR 检测方法，为诊断提供了有力的工具，这种方法可以作为类似问题的有效解决方案。

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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