【Nature Communi】奥胡斯大学揭示促进百脉根瘤菌感染的基因

2023 年 11 月 7 日，丹麦奥胡斯大学 在 Nature Communications 杂志上在线发表了题为 "Single-cell analysis identifies genes facilitating rhizobium infection in Lotus japonicus" 的研究论文。

图 1 百脉根瘤菌侵染的细胞图谱

为了根据组织类型对细胞进行分类并确定细胞对根瘤菌感染的反应，本研究对模拟处理和根瘤菌接种的莲藕的原生质体进行了单细胞RNA测序，每种条件下两个生物复制，每个生物复制约150个整根。过滤后共25,024个细胞、13,241个来自对照样品的细胞和11,783个来自接种样品的细胞进行了表征。然后使用Seurat对样品进行整合和聚类，产生32个聚类（图1a,b）。使用来自Lotus Base的标记基因信息、来自拟南芥的同源标记和启动子报告基因确定了单个簇的细胞身份（图1a，b）。在接种和未接种的样品中都鉴定出了所有已知的莲藕组织，这表明原生质体甚至对更深的根组织和脉管系统也是有效的。使用调整p值的MAST算法，发现大多数组织类型和组织内的亚簇对根瘤菌感染有显著的转录反应 ≤ 0.05和logFC≥|0.25|。反应最差的组织是韧皮部，尤其是静止中心细胞（簇28）和木质部（簇29）（图1c）。对接种有反应的簇，包括簇4、14和22，在处理的样品中过度表达，而无反应的簇（如簇29（木质部）和簇30（韧皮部））在对照样品中过度出现。由于原生质体可以引起应激相关的转录反应，研究者使用批RNA测序对整个根和原生质体的转录组进行了比较。鉴定了655个由原生质体诱导的基因，这些基因在基因列表中被标记为“原生质体诱导”。

图 2 Infected, nodule and bacteroid-containing cells

in Lotus roots 10 dpi

在将细胞映射到组织类型后，接下来专注于识别对根瘤菌感染有特异性反应的细胞亚群。目标群体是受感染的细胞，在感染线内携带根瘤菌，未受感染但形成根瘤结构一部分的根瘤细胞，以及进行固氮的类杆菌细胞（图2a）。为了鉴定受感染的细胞，仅使用接种根瘤菌的样品数据，以强调感染转录反应对聚类的影响。检查感染相关结瘤基因NPL24的表达模式和其他感染相关基因，鉴定了一个代表感染细胞的簇。然后，可以在包括所有样本的原始UMAP中突出显示它们的位置，并在根毛（簇9）和皮层（簇8）中识别受感染的细胞。对于结节细胞，发现簇14显示出结节标记基因CARBONIC ANHYDRASE47（ßCA1）的特异性表达，并将簇14中的 98 ßCA1表达细胞定义为结节细胞（图2c）。最后，基于其血红蛋白基因LB1、LB2或LB348的表达，鉴定了来自簇8的21个细胞为拟杆菌细胞（图2d）。

图 3 Root hair- and cortex-IT cells

 share common and separate gene sets

为了发现可能参与结瘤过程的基因，研究者选择了对三个群体中的每一个都具有高度特异性表达模式的候选者，要求它们被鉴定为目标群体的标记，并且在所有其他细胞中表达率低于2%。鉴定了592个符合这些标准的基因，其中大多数是单个群体特有的（图2e）。也存在大量重叠，特别是在感染细胞和拟杆菌细胞候选者之间，47个实验验证的结瘤基因中有21个包含在候选者中（图2e）。其他26个基因也在这些细胞群中发现，但在所有其他细胞中表达率超过2%。NF-YA1和NIN被确定为所有三个群体的候选者（图2e）。

为了验证方法，作者使用了一组独立的根毛体RNA-seq数据。研究者封闭根毛细胞，并使用剪刀鉴定对根瘤菌接种有反应的36个RH细胞的不同亚群（图2f）。将细胞群体与其余RH细胞进行了比较，并生成了包含67个基因的标记基因列表。该亚群的标记基因列表包括众所周知的感染相关基因，如NPL、NF-YA1和NIN，并且如NPL所示，对该亚群是特异性的（图2g）。将149个感染的细胞标记基因和67个剪刀+标记基因进行了交叉，确定了50个基因的大量重叠。

图 4 Cyclops RH and cortex cells

display unique features preventing IT formation

接下来，作者检查了LotjaGi2g1v0191100编码的蛋白质序列，鉴定了一个预测的串联马来凝集素样基序（马来凝集素样结构域，MLD）和三个富含亮氨酸的重复序列（LRR），它们与Lotus SYMRK的外结构域共享136/545（25%）氨基酸同一性。为了确定结构相似程度，使用AlphaFold对这两种蛋白质进行建模。尽管氨基酸同源性相对较低，但这两个模型几乎相同，叠加均方根偏差值为1.8 Å。作者将蛋白质命名为SYMRK-LIKE1（SYMRKL1）。与它们的外结构域的明显相似性相反，SYMRK包含跨膜和细胞内激酶结构域，而SYMRKL1通过预测的GPI锚连接到膜上，并且缺乏细胞内激酶域。

为了在功能上验证SYMRKL1在根瘤菌感染中发挥作用的假设，分离了两个LORE1 SYMRKL1突变等位基因，并检测了它们的感染表型。symrkl1突变体在根瘤数量和根瘤发育方面与野生型植物无法区分。相反，突变体显示出大量明显异常的感染线，显示出各种缺陷。其中包括增大的鳞茎、侧枝和细菌的过早释放。

转自：“iPlants”微信公众号

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