NBE | 清华大学戴琼海等团队开发新的成像技术,以实现先前重建的厘米尺度任意形状表面的视频速率成像
2024/1/3 17:25:02 阅读:101 发布者:
荧光显微镜允许对哺乳动物大脑区域的细胞活动进行高通量成像。然而,由于图像分辨率、速度、视野和景深的权衡,在弯曲的皮质表面捕捉快速的细胞动力学是具有挑战性的。
2023年12月6日,清华大学戴琼海及谢浩共同通讯在Nature Biomedical Engineering(IF=28)在线发表题为“Multifocal fluorescence video-rate imaging of centimetre-wide arbitrarily shaped brain surfaces at micrometric resolution”的研究论文,该研究报告了一种宽视场荧光成像技术,该技术利用选择性照明和通过具有不同厚度的旋转盘在不同深度集成焦点区域,以实现先前重建的厘米尺度任意形状表面的视频速率成像,分辨率为微米级,景深为毫米。
通过在一台每秒能获取16.8亿像素、每秒能分辨168亿体素的显微镜上实现这项技术,实时记录了活体小鼠弯曲皮质表面上的神经活动和中性粒细胞的轨迹。该技术可以集成到许多显微镜和宏观显微镜中,在反射和荧光模式下,用于研究任意形状表面上的多尺度细胞相互作用。
跨多个脑区神经相互作用的系统级研究需要高通量记录细胞活动,具有高空间和时间分辨率。颅骨窗技术的最新进展促进了对小鼠皮质广泛区域的直接光学访问,通过使用弯曲玻璃或聚合物光学窗或通过使用生物相容性试剂来清除颅骨。然而,一个实质性的挑战在于在复杂的非平面表面上对皮层进行细胞分辨率成像,特别是在研究功能不同的皮层区域广泛的细胞相关性时。
复杂形状表面的介观细胞成像可以通过串行或并行方法来完成。串行方法包括扫描整个表面并使用快速调焦或点扩散函数(PSF)工程实现焦点转移。例如,双光子随机访问介观镜通过高效采样,可以在整个成像体积中对任意感兴趣区域的神经活动进行快速3D成像,这在串行方法中取得了进步。尽管如此,串行方法的吞吐量仍然受到光栅扫描、激光重复率和检测带宽等因素的限制,通常达到每秒1亿像素。
另一方面,并行方法可以使用电荷耦合器件或互补金属氧化物半导体(CMOS)技术同时记录来自多个源的荧光强度,利用多摄像机实现微尺度分辨率和厘米尺度视场(FOV)的视频速率成像峰值推理算法,如扩展约束非负矩阵分解(CNMF-E)12和深宽视场神经元检测器(DeepWonder),已被用于从宽视场图像中检测和提取细胞活动,从而实现高通量分析。然而,实现整个复杂形状表面的高速成像仍然是一个巨大的挑战,主要是因为难以在整个视场内快速改变焦平面。
系统原理图(图源自Nature Biomedical Engineering )
已经开发了几种方法来增加广角荧光显微镜的景深(DOF)。一种常用的方法是快速轴向扫描。带压电级的机械轴向扫描在高速下无法处理物镜或试样的重量。使用额外中继光学器件的远程聚焦技术对于中尺度宽视场探测是不切实际的,因为它们会导致系统更复杂,光传输减少,成本更高。大多数电可调透镜和可调声学梯度折射率透镜(TAG透镜)在视场、分辨率和速度之间存在权衡,因此不适合中尺度高通量成像。虽然多致动器自适应透镜已经开发出几百赫兹的速率,但由于其孔径大小有限,尚未应用于中尺度显微镜。
在复杂形状表面的中尺度成像中,一个显著的进步是通过同步多焦光学采样显微镜观察皮层,该显微镜已经实现了清醒小鼠整个背皮层表面的高速近细胞分辨率成像,但由于其大像素尺寸,细胞动力学无法区分。第二种方法是延长PSF以增加轴向范围:一种直接的方法是减小数值孔径(NA)以增加DOF,这导致分辨率降低,信噪比降低,光漂白和毒性增加;球面像差、无衍射光束(如贝塞尔光束和艾里光束)和孔径分割法也被用于增加DOF,但这些方法也会导致副瓣、低信噪比或重建伪影。第三种方法涉及计算方法,如光场显微镜和z编码方法,它们同时捕获体积信息。这些方法通常需要额外的先验信息,如高分辨率重建的稀疏性,因此它们容易产生重建伪影。在厘米尺度视场和微米尺度分辨率的限制下,上述技术都无法有效地实现非平面表面的高速定向成像。
该研究开发了一种宽视场荧光显微镜,旋转圆盘任意表面多焦点荧光成像(MFIAS),它可以在非平面表面上成像,同时在大视场范围内保持高空间分辨率。还开发了一个主动成像框架,包括表面轮廓的自动检测,时空编码照明的主动控制,高速旋转盘扫描和多路检测。利用旋转圆盘的高光学吞吐量和高速相机(如实时超大规模高分辨率宏显微镜(RUSH)系统和微型相机阵列显微镜,MFIAS可以实现每秒168亿体素的扫描速率,允许在大约2毫米的最大范围内几乎连续调整焦深和视频速率采集。该研究已经证明了MFIAS宏观显微镜的能力,通过成像神经活动和中性粒细胞在完整的小鼠浅表皮层上的迁移以及复杂表面上的其他动态过程。MFIAS在提供无伪影的生物图像方面是可靠的,在不同的实验系统和条件下是灵活的,并且在实施中具有成本效益,使其成为生物学研究的宝贵工具。
原文链接:
https://www.nature.com/articles/s41551-023-01155-6
转自:“iNature”微信公众号
如有侵权,请联系本站删除!