Nat Chem Biol | 复旦大学王永明等团队合作利用噬菌体辅助的进化方法改造Cas9
2024/1/3 17:23:43 阅读：86 发布者：
紧凑型Cas9核酸酶在治疗应用方面具有很大的前景。尽管已经开发出了几种紧凑的Cas9核酸酶，但由于缺乏原间隔器邻近基序(PAMs)，许多基因组位点仍然无法编辑。
2023年12月5日，复旦大学王永明、郑州大学唐俊楠及北京大学郑威共同通讯（齐涛为本文的第一作者）在Nature Chemical Biology 在线发表题为“Phage-assisted evolution of compact Cas9 variants targeting a simple NNG PAM”的研究论文，该研究开发了一种简单的噬菌体辅助进化来设计SlugCas9，以满足独特的PAM需求。
有趣的是，研究人员生成了一个可以识别NNG PAM的SlugCas9变体(SlugCas9-NNG)，扩大了靶向范围。进一步开发了基于SlugCas9-NNG的腺嘌呤碱基编辑器，并证明它可以通过单个腺相关病毒递送，以破坏PCSK9剪接供体和剪接受体。总之，这些基因组编辑器极大地增强了人们体内基因组编辑的能力。
CRISPR- CRISPR相关蛋白9 (Cas9)系统彻底改变了人们在真核细胞中编辑基因组的能力。在该系统中，Cas9核酸酶和嵌合单导RNA (chimeric single guide RNA, sgRNA)组成核糖核蛋白，搜索并切割与sgRNA 5′端互补的基因组靶DNA。该系统的一个关键限制是目标DNA识别严格要求互补DNA序列下游的一个称为原间隔邻近基序(PAM)的短DNA序列，限制了可靶向的基因组位点。
精确的Cas9定位通常需要许多应用，如碱基编辑、引物编辑和位点特异性DNA重组。扩大靶向范围的一种策略是使用多种天然Cas9核酸酶进行基因组编辑，每种核酸酶识别不同的PAM。例如，SpCas9识别NGG PAM7；St1Cas9识别一个NNRGAA PAM (R = A, G)；ScCas9识别NNG PAM。另一种策略是设计现有的Cas9核酸酶来识别柔性PAM。针对灵活的PAM需求，已经开发了几个SpCas9变体。例如，SpCas9-NG识别一个简单的NG PAM;SpRY几乎可以识别所有PAM。然而，SpCas9及其变体对于单个腺相关病毒(AAV)递送用于体内治疗应用来说太大了。
噬菌体辅助进化示意图（图源自Nature Chemical Biology ）
紧凑型Cas9核酸酶特别有趣，因为它们可以被包装成单个AAV。之前开发了几种紧凑的Cas9核酸酶，如SaCas9 (NNGRRT PAM)、CjCas9 (N4RYAC PAM, Y = C, T)、Nme2Cas9 (N4CC)、BlatCas9 (N4CNAA PAM)、SlugCas9 (NNGG PAM)和SchCas9 (NNGR PAM)，用于哺乳动物基因组编辑。这些Cas9核酸酶共同识别多个PAM。同时，利用少量Cas9核酸酶实现大范围的基因组编辑更具吸引力。理论上，具有单核苷酸PAM要求的4种Cas9核酸酶可以识别所有PAM。
文章模式图（图源自Nature Chemical Biology ）
噬菌体辅助进化已被证明是一种有效的技术，可以设计Cas9核酸酶以实现独特的PAM识别。它已被用于设计SpCas9和Nme2Cas9独特的PAM要求。在这里，作者开发了一种改进的噬菌体辅助进化策略来设计一个紧凑的SlugCas9，以满足独特的PAM需求。有趣的是，研究人员开发了一种SlugCas9变体(SlugCas9-NNG)，它可以识别简单的NNG PAM，极大地增强了人们在体内基因组编辑的能力。进一步开发了一种基于SlugCas9-NNG的腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，可以通过单个AAV传递。综上，SlugCas9-NNG和SlugABE-NNG靶向范围大，在基础研究和临床应用方面都有很大的潜力。随着识别单腺嘌呤PAM的Cas9的进一步发展，四个Cas9将覆盖所有PAM。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41589-023-01481-5
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