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Adv Sci | 西北农林科技大学王小龙等团队开发新型线粒体碱基编辑器

2024/1/3 14:01:20  阅读:136 发布者:

线粒体作为细胞的“能量工厂”,可为细胞活动源源不断地提供能量。人类线粒体DNA (mtDNA)共包含37个基因,主要参与细胞线粒体内的氧化磷酸化过程。mtDNA基因变异可能会导致能量代谢障碍并产生复杂的临床症状,例如Leigh综合征、线粒体脑肌病及衰老等几十种疾病。线粒体DNA被细胞器膜包裹,形成了生物屏障,CRISPR系统及基于此的单碱基编辑器由于RNA组分难以进入线粒体膜,在线粒体编辑领域尚无实际应用。基于RNA-free的全蛋白基因编辑工具ZFNTALEN可以在线粒体定位信号的引导下进入线粒体,以靶向敲低突变或不同的mtDNA拷贝[1-2]。然而,针对(单碱基)纯合的线粒体突变,敲低线粒体基因组或者改变碱基构成,理论上不可行。

2020年,Joseph Mougous团队和David Liu团队合作利用TALE与双链DNA脱氨酶DddA融合,研发了线粒体碱基编辑工具DdCBE,其可针对双链mtDNA实现C>T的碱基编辑[3]。然而,该工具序列兼容性低,只针对5-TC有较高的编辑效率,极大地限制了其应用范围。David Liu团队利用噬菌体辅助进化系统获得DddA突变体DddA6DddA11,实现了5-HC (H=A, C, T)序列中C>T的编辑,然而5-GC的编辑依然受限[4]。针对这一问题,汪阳明团队、乔云波团队和沈彬团队通过挖掘DddA同源蛋白,克服了DdCBE工具受DNA序列的编辑限制[5-7]2022年,Jin-Soo Kim团队通过在DddA基础上融合单链腺嘌呤脱氨酶TadA8e (该系统命名为TALED),实现了mtDNAA>G的碱基编辑,但效率较低[8]。最近,魏文胜团队报道了一种全新的线粒体碱基编辑工具mitoBEs,它不依赖于DddA系统,不仅能够高效地实现C>TA>G的单碱基编辑,还具备选择性地编辑特定链的能力[9]

20231120日,西北农林科技大学王小龙团队联合上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院李文/章美玲团队、上海脑科学与类脑研究中心/临港国家实验室胥春龙团队合作在Advanced Science 杂志上在线发表了题为“Enhanced C-To-T and A-To-G Base Editing in Mitochondrial DNA with Engineered DdCBE and TALED”的研究论文。

研究通过在DddA11基础上融合10种具有单链DNA活性的胞嘧啶脱氨酶,其中来自Xenopus laevisAID (activation-induced cytidine deaminase)(简称xAID)展现出较高的碱基编辑活性,同时表现出较强的5-GC偏好性(图1)。另外,研究人员在DddA11-xAID基础上通过引入已报道的DddA高保真位点和多种核输出信号(nuclear export signal, NES) 序列,同时通过全基因组测序、全线粒体高通量测序和扩增子测序系统评估了优化的DdCBE工具的mtDNA和核DNA脱靶活性,发现DddA11-T1391A-xAID-NES2版本具有编辑活性高、范围广及特异性强的特征。

1. 引入单链DNA活性的胞嘧啶脱氨酶显著提高了DdCBE系统C-to-T碱基编辑活性

其次,研究人员通过替换TALED系统中的DddA元件为DddA6,显著性地提高了mtDNAA>G的碱基编辑效率(最高达18倍)(图2)。与DdCBE系统优化方案相似,作者们通过进一步引入已报道的DddA高保真位点和多种NES序列,同时通过全基因组测序、全线粒体高通量测序和扩增子测序系统评估了优化的TALED工具的mtDNA和核DNA脱靶活性,发现DddA6-Q1310A-AD-V106W-NES1版本具有编辑活性高及特异性强的特征。

2. 替换TALED系统中DddADddA6显著提高了其A-to-G碱基编辑活性

最后,研究人员利用工程化的DdCBE工具(DddA11-T1391A-xAID-NES2)和TALED工具(DddA6-Q1310A-AD-V106W-NES1)结合split-DddAtox的位置和方向,针对具有5-GC偏好性、可模拟Leber遗传性视神经病变(m.3635G>A)位点和可模拟线粒体神经肌肉综合症(m.10010T>C)位点,在HEK293T细胞系上分别成功构建了可模拟这两种疾病的线粒体基因突变,发现这些突变会引起线粒体功能紊乱,例如出现ATP水平、线粒体呼吸链复合体IIV水平降低及ROS水平上升等异常情况(图3)。

3. 利用工程化的DdCBETALED系统成功构建了模拟人类线粒体疾病的细胞模型

综上,本研究工程化的DdCBETALED工具显著提高了线粒体基因组的靶向效率、特异性或序列兼容性,对推动线粒体遗传机制研究和基因治疗具有重要意义。

西北农林科技大学王小龙教授、魏迎辉教授和上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院李文教授、章美玲副研究员及上海脑科学与类脑研究中心/临港国家实验室胥春龙研究员为论文的共同通讯作者。西北农林科技大学动物科技学院的魏迎辉教授、在读研究生黄舒泓、姚方瑶及福建医科大学金铭博士为论文的共同第一作者。本研究亦得到西北农林科技大学陈玉林教授及辉大基因杨辉研究员、周英思博士和任宁欣的大力支持。本研究受到国家自然科学基金、“科技创新-2030”重大专项、国家现代农业产业技术体系和西北农林科技大学人才项目等项目资助。

原文链接:

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202304113

参考文献

[1] P. A. Gammage, et al. Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo. Nat. Med. 2018, 24, 1691-1695.

[2] S. R. Bacman, et al. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation. Nat. Med. 2018, 24, 1696-1700.

[3] B. Y. Mok, et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature 2020, 583, 631-637.

[4] B. Y. Mok, et al. CRISPR-free base editors with enhanced activity and expanded targeting scope in mitochondrial and nuclear DNA. Nat. Biotechnol. 2022, 40, 1378-1387.

[5] L. Mi, et al. DddA homolog search and engineering expand sequence compatibility of mitochondrial base editing. Nat. Commun. 2023, 14, 874.

[6] J. Guo, et al. A DddA ortholog-based and transactivator-assisted nuclear and mitochondrial cytosine base editors with expanded target compatibility. Mol. Cell 2023, 83, 1710-1724.

[7] H. Sun, et al. Developing mitochondrial base editors with diverse context compatibility and high fidelity via saturated spacer library. Nat. Commun. 2023, 14, 6625.

[8] S. I. Cho, et al. Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases. Cell 2022, 185, 1764-1776.

[9] Z. Yi, et al. Strand-selective base editing of human mitochondrial DNA using mitoBEs. Nat. Biotechnol. 2023, https://doi.org/10.1038/s41587-023-01791-y.

转自:iNature”微信公众号

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