导读
铁皮石斛（DEN）是我国自汉代以来的传统药材，其茎常用于治疗II型糖尿病（T2D）。T2D是一种典型的代谢性疾病，伴有血糖和脂质代谢功能受损。我们旨在研究肠道微生物群在区分不同来源DEN中的作用及在缓解T2D诱导的代谢综合征中的相关途径；制备了四种市售石斛（DEN-1~4）的水提取物，并通过体外发酵系统进行了筛选。基于它们在用db/db粪便液发酵过程中单糖组成和短链脂肪酸（SCFAs）形成的变化，选择了一种DEN提取物进行进一步的体内验证。我们将所选石斛（DEN-4）以200 mg/kg剂量灌胃给db/db小鼠16天，每天一次，然后评估其对血糖水平、肝功能和肠道微环境的影响，包括肠道完整性和肠道菌群组成改变；此外还采用肝脏代谢组学分析来揭示相关的代谢途径。结果发现不同来源的四种DEN提取物的SCFAs形成和单糖利用程度不同，我们在db/db粪便液的体外发酵系统中发现SCFA水平与利用的葡萄糖/甘露糖的比率呈负相关。我们选择了在体外发酵过程中SCFAs形成最高的DEN-4，并可显著降低db/db小鼠的血糖，减轻了肝脂肪变性和脂质稳态受损。进一步的机制研究表明，口服DEN-4可以通过提高db/db小鼠结肠中紧密连接蛋白（ZO-1和Occludin）的表达来改善其肠道完整性，并通过增强SCFAs的形成来改善肠道菌群的多样性。代谢组学和肝组织KEGG通路分析表明，DEN-4减轻db/db小鼠代谢综合征可能是通过激活PPAR通路实现的。本研究不仅揭示了肠道菌群在区分不同来源DEN方面的潜力，还表明DEN对T2D诱导的代谢综合征具有益处，可能是通过增强db/db小鼠的肠道完整性和肠肝轴激活PPAR途径实现的。
研究热点：
1. DEN通过改善肠道完整性、肠道微生物群多样性和增强SCFA的形成来改善db/db小鼠的代谢综合征；
2. DEN可能通过肠肝轴减轻db/db小鼠的代谢综合征；
3. 肠道菌群利用葡萄糖/甘露糖比率较低的DEN产生更多的SCFAs。
论文ID
原名：Role of gut microbiota on regulation potential of Dendrobium officinale Kimura & Migo in metabolic syndrome: In-vitro fermentation screening and in-vivo verification in db/db mice
译名：肠道菌群在铁皮石斛调节代谢综合征中的作用：体外发酵筛选及db/db小鼠体内验证
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.4
发表时间：2023.11
通讯作者：左中
通讯作者单位：香港中文大学
实验设计
实验结果
1. DEN提取物在db/db小鼠粪液发酵过程中的不同化学变化
由于肠道微生物群显著参与了DEN的生物活性，因此有必要分析与肠道微生物群发酵后DEN的化学变化，以发现潜在的生物活性代谢产物。在本研究中，我们在体外发酵系统中模拟和监测了肠道微生物群对不同DEN水提取物的影响。硫酸-蒽酮分析（图1A）显示，在发酵过程中，四种DEN水提取物的残留糖率显著降低，这表明所有四种DEN水提取物中多糖都可以被肠道微生物群利用。如图1B–E所示，由于没有7.0×105 Da的大分子峰（峰a），DEN-1的分子量分布与DEN-2~4不同。尽管DEN-2~4的分子量分布相似，但DEN-4中a峰的面积明显更大，表明高分子量多糖在DEN-4中的比例更高。发酵后，四种DEN提取物的分子量分布非常相似，仅在1500Da和200Da左右有两个峰。在发酵过程中，原始DEN-2~4提取物中没有大分子峰（分子量约为7.0×105 Da），这可能是肠道微生物群利用的结果。此外，单糖组成分析（图1F–I）表明，DEN-1~4中的甘露糖和葡萄糖都被肠道微生物群利用。如图1J所示的进一步分析表明，四种DEN提取物的利用葡萄糖/利用甘露糖摩尔比存在显著差异，其排序为DEN-1>DEN-2≈DEN-3>DEN-4。
图1 粪液发酵对DEN-1～4的（A）残糖率、（B–E）分子量分布、（F–I）单糖组成和（J）利用葡萄糖/利用甘露糖摩尔比的影响。****：p＜0.0001，*：p＜0.05。
SCFAs是肠道微生物群利用植物纤维产生的重要生物活性代谢产物。在目前的研究中，我们通过GC-MS监测发酵液中的三种主要SCFA水平（乙酸、丙酸和丁酸），观察到与空白培养基对照相比，所有DEN用db/db粪便液发酵48小时后，所有三种SCFA水平都显著增加（图2）。尽管在丙酸水平无显著差异，但在粪便液中发酵48小时后，乙酸的产生呈现出DEN-4>DEN-2>DEN-3>DEN-1的顺序，丁酸的产生呈现为DEN-4>DEN-1≈DEN-2≈DEN-3的顺序。这些结果表明，肠道微生物群对不同DEN提取物的体外发酵导致不同水平的SCFA形成，这意味着肠道微生物群的体外发酵可以作为DEN质量评估的筛选工具。进一步的相关性分析表明，总SCFA（乙酸、丙酸和丁酸的总和）水平与利用的葡萄糖/甘露糖的摩尔比有关，两者之间存在显著的负相关（R2=0.5466，p<0.01）。
根据《中国药典》，多糖被认为是DEN水提取物的主要生物活性成分。以往的文献主要关注多糖的单糖组成，以区分不同来源的DEN，由于缺乏对这些单糖的生物活性，可能无法反映其质量。由于DEN中的多糖主要由肠道微生物群利用，因此监测其在大肠中的化学变化以发现更适合DEN质量评估的生物标志物是很重要的。在本研究中，我们在体外发酵系统中评估了肠道微生物群对四种DEN水提取物多糖的影响，并监测了它们的化学变化和SCFA的形成。我们不仅首次证明了不同来源的DEN之间SCFA的形成和甘露糖/葡萄糖的利用有显著差异，而且发现总SCFA水平与利用的葡萄糖/甘露糖摩尔比呈显著负相关，这表明总SCFA水平和利用的葡萄糖/甘露糖的摩尔比可以作为DEN质量评价的合适指标。先前的研究发现，SCFA表现出一系列的生物活性，包括抗炎和刺激GLP-1分泌。因此，在四批样品中，我们选择了SCFA形成最高的DEN-4，以进一步体内验证其对db/db小鼠代谢综合征的调节潜力。
图2 DEN-1~4发酵48小时后（A-D）短链脂肪酸水平和（E）pH变化的比较，以及总短链脂肪酸（SCFA）水平与利用的葡萄糖/利用的甘露糖摩尔比之间的（F）相关性分析。非共享字母表示两个相应组之间的显著差异（p<0.05），而共享字母表示没有显著差异（p>0.05）。R是与阴影区域的相关系数，表示95%的置信区间。
2. 口服DEN-4对db/db小鼠代谢综合征的缓解作用
2.1 DEN-4对db/db小鼠的降血糖作用
如图3A所示，db/db组的小鼠表现出糖尿病症状，空腹血糖水平明显高于正常对照（WT）组。DEN-4处理后，DEN-4组db/db小鼠的空腹血糖水平（9.2±3.7mmol/L）显著降低。腹膜内葡萄糖耐量（ipGTT）试验还显示，与db/db组（3050.0±223.4 mmol/L*min）相比，DEN-4组的ipGTT结果（2150.0±445.5 mmol/L*min.）显著下降（图3B）。关于胰岛素耐受测试（图3C），与WT组相比，db/db组的胰岛素响应潜力显著恶化。然而，DEN-4处理后，DEN-4组的胰岛素抵抗（1694.0±413.1 mmol/L*min）与db/db组（2278.0±196.5 mmol/L*min.）相比有显著改善。此外，DEN-4组（图3D~E）与db/db组相比，空腹胰岛素水平（100.6±22.1mIU/L）和计算的HOMA-IR指数（38.7±7.7）显著降低，提示DEN-4在改善db/db小鼠胰岛素抵抗方面的潜力。
图3 DEN-4对血糖水平、肝功能和血脂的影响
（A）空腹血糖水平，（B）ipGTT试验的曲线下面积值，（C）iTT试验的曲线下面积值表示，（D）空腹胰岛素水平，（E）HOMA-IR指数，（F）血清丙氨酸转氨酶（ALT），（G）血清天冬氨酸转氨酶（AST），（H）血清总胆固醇（TC），（I）血清甘油三酯（TG），（J）血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）和（K）血清低密度脂蛋白胆甾醇（LDL-c）。与db/db组相比，*p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001，***：p＜0.0001。
2.2 DEN-4对db/db小鼠血脂水平和肝功能的改善作用
先前的研究表明，胰岛素抵抗与脂质代谢紊乱和非酒精性脂肪肝的发生密切相关。如图3F–K所示，db/db组的HDL-c、LDL-c、TG、TC、ALT和AST水平显著高于WT组，表明db/db小鼠的肝功能损伤和血脂异常（p<0.01）。DEN-4处理后，这些血清参数与db/db组相比有显著改善（p<0.01）。组织学数据（图4A–B）也支持用DEN-4处理后，db/db小鼠的肝脏脂肪变性和胰腺萎缩得到逆转。免疫组织化学染色（图4C–D）显示，用DEN-4处理后，db/db小鼠胰腺中的胰岛素分泌增强。总之，这些发现表明DEN-4对T2D诱导的代谢综合征表现出显著的有益作用。
图4 DEN-4对胰腺和肝脏组织学的影响
（A）肝脏HE染色（×200）。（B）胰腺HE染色（×200）。（C）胰腺胰岛素的免疫组织化学染色（×200）。（D）使用Image-J对胰岛素染色进行定量。
3. DEN-4对db/db小鼠肠道微环境的调控
3.1 口服DEN-4增强db/db小鼠的肠道完整性
据报道，糖尿病患者通常被诊断为一系列炎症症状和肠道完整性受损。临床证据也支持T2D患者的代谢综合征在重塑肠道微环境后得到改善。因此，我们还对DEN-4处理后db/db小鼠的肠道微环境进行了分析。为了监测db/db小鼠的肠道完整性，我们采用体内异硫氰酸荧光素（FITC）右旋糖酐测定法。与db/db组（464.3±55.02μg/mL）相比，WT组（28.55±5.25μg/mL）、二甲双胍（MET）组（229±13.15μg/mL.）和DEN-4组（278.9±24.15μg/mL.）的血浆FITC浓度显著降低，此外，db/db组的血清脂多糖（LPS）水平（0.321±0.030 ng/mL）显著高于WT组（0.270±0.004 ng/mL），这与T2D患者的高炎症症状一致。DEN-4处理16天后，血清LPS水平（0.281±0.002 ng/mL）显著降低（图5B）。
进一步的组织学研究（图5C）显示，db/db小鼠的肠道完整性因回肠间质存在部分脱落的上皮细胞和严重的炎症浸润而恶化，在用DEN-4处理后，这些细胞也被有效地减弱。TEM和SEM结果也支持了DEN-4对肠道完整性的有益影响，即用DEN-4处理后，肠道黏膜的严重剥落得到改善，紧密连接得到恢复（图5D–E）。免疫印迹结果（图5F）表明，用DEN-4处理可以显著增强结肠组织中ZO-1和Occludin的相对表达，表明DEN-4有利于db/db小鼠的肠道完整性。总之，我们的体外发酵系统选择的DEN-4不仅可以调节db/db小鼠的脂质和葡萄糖代谢，而且可以显著增强肠道完整性，同时降低炎症水平。这一综合证据首次证明了其改善db/db小鼠代谢综合征的潜力。
图5 DEN-4处理对肠道完整性的影响
（A）血浆FITC-右旋糖酐浓度，（B）LPS血清浓度，（C）结肠HE染色（×200），（D）透射电子显微镜的结肠图像（×8000），（E）扫描电子显微镜的结肠癌图像（×4000）和（F）结肠中ZO-1和Occludin的蛋白表达。与db/db组相比，*p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001，***：p＜0.0001。
3.2 口服DEN-4增加db/db小鼠肠道微生物群的多样性和SCFA的形成
肠道微生物群作为肠道微环境的重要组成部分，广泛参与各种生理途径。在我们目前的研究中，确定了微生物组成及其生物多样性，以评估DEN-4对肠道微生物群的影响。首先，肠道细菌在门水平上的相对丰度（图6A）表明拟杆菌门在db/db小鼠中的丰度低于健康小鼠。进一步的属水平分析表明，Muribaculaceae、Escherichia-Shigella、Lachnoclostridium、Odoribacter和Lachnospiraceae_UCG-006是db/db小鼠的主要肠道微生物，而健康小鼠主要包括Muribaculaceae、肠球菌、Lachnospiraceae_UCG-006、Lachnoclostridium和Escherichia-Shigella。用DEN-4处理后，db/db小鼠的拟杆菌门丰度下降得到逆转。属水平进一步分析（图6B）揭示了每个处理组之间细菌组成的差异。与WT组相比，db/db组在ASV聚类上表现出最显著的差异，维恩图中包括1553个不同的ASV（图S3）。DEN-4处理导致不同ASV的数量显著减少，只有766种不同的ASV。这些结果表明，DEN-4可以减少db/db小鼠与正常小鼠之间的微生物差异，这意味着DEN-4可以恢复db/db鼠肠道菌群的微生态失调。此外，我们通过生物多样性分析对肠道微生物群落的丰度和多样性进行了评价。结果（图6C）显示，与WT组相比，db/db组的丰度和多样性显著下降。DEN-4处理后，DEN-4组的Simpson和Shannon指数显著高于db/db组，而Chao_1指数和观察到的OTU没有显著差异，表明DEN-4可以通过改善肠道微生物群的物种多样性而不是丰度来调节糖尿病小鼠肠道菌群微生态失调。
SCFA作为肠道微生物群的主要代谢产物，在db/db小鼠中的形成也进行了评价。结果显示，db/db小鼠粪便中的乙酸和丁酸水平显著低于WT小鼠，而丙酸水平没有显著差异（图6D）。DEN-4处理后，与db/db组相比，所有三种SCFA都显著增加。目前的体内研究还表明，SCFA产生较高的db/db小鼠表现出改善的肠道完整性和增强的紧密连接蛋白表达，这得到了先前体外细胞研究的支持，即丁酸可以改善紧密连接蛋白的表达并抑制炎症因子的产生。因此，我们在db/db小鼠中的体内证据也支持了这一发现，即SCFA是肠道微生物群产生的关键生物活性代谢产物，可能是DEN质量评估的合适指标。
图6 DEN-4处理对肠道微生物群相对丰度的影响（A）在门水平（前10个门）和（B）属水平（前35个属），（C）肠道微生物群群落的多样性和丰度分析以及（D）SCFA的形成。与db/db组相比，*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001，***：p＜0.0001。
4. DEN-4对db/db小鼠肝脏代谢功能的调节作用
先前的研究发现，短链脂肪酸钠盐可以通过调节肠道完整性来改善肝脏代谢功能。本研究还表明，DEN可以通过增强肠道完整性和更高的SCFA形成来缓解db/db小鼠的代谢综合征。为了揭示DEN-4处理后肠道微环境改善与代谢综合征缓解之间的联系，我们对肝脏进行了代谢组学分析，共鉴定了1675种代谢产物，包括在正离子模式下检测到的907种代谢产物和在负离子模式下检测到的768种代谢产物（图S4C–S4D）。根据主成分分析（PCA）模型的结果，WT、db/db和DEN-4组之间的代谢物存在显著差异（图S4A–B）。最后，我们通过层次聚类确定了db/db组和DEN-4组之间的76种差异代谢物（图7A），详细信息如表S2所示。
我们使用KEGG富集分析将这些差异代谢物的功能注释到KEGG途径中（图7B）。结果（图7C）表明，代谢途径主要包括消化系统、膜转运、碳水化合物代谢、脂质代谢、氨基酸代谢和胆汁酸代谢。在这些代谢途径中，DEN-4组有7条途径的差异丰度（DA）评分为负（＜0），12条途径的DA评分为正（＞0）。上调的代谢途径包括ABC转运蛋白、丁酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、氨基酸代谢、胆汁酸代谢和PPAR信号通路，而下调的代谢途径包括脂肪酸代谢、花生四烯酸代谢、嘌呤代谢和FoxO信号通路。这些结果支持DEN-4处理将db/db小鼠置于高能量消耗状态。同时，我们发现PPAR信号传导和嘌呤代谢是DEN-4组和db/db组之间不同的代谢途径。此外，本研究表明，DEN-4可以通过增强肠道微生物群多样性和更高的SCFA形成来缓解db/db小鼠的代谢综合征，这表明肠肝轴可能在DEN-4改善肝脏脂肪变性中发挥作用。有人指出，过度暴露于有害的微生物代谢产物会导致肝脏代谢综合征，这意味着对紊乱肠道微环境的调节可能是代谢综合征的潜在治疗策略。在当前研究中，我们发现DEN-4处理不仅可以增强肠道微生物群的多样性，还可以通过增加紧密连接蛋白的表达来改善肠道完整性，以防止有害微生物代谢产物的流入，并进一步保护宿主肝脏。此外，我们目前的体内研究表明，DEN可导致粪便中SCFA的产生增加，DEN-4组和db/db组之间最独特的肝脏代谢产物被注释为PPAR信号通路，这得到了先前关于SCFA激活PPAR途径的体外机制研究结果的支持，可以恢复肝脏能量消耗的平衡。进一步的免疫印迹分析（图7D）证实，与C57BL/6J小鼠相比，db/db小鼠肝脏中PPAR-α表达的降低可以通过DEN-4处理逆转，这与之前关于DEN水提取物的报道一致。同时，我们首次发现，DEN-4处理后，db/db小鼠肝脏中PPAR-γ的表达显著增加（与C57BL/6J小鼠相比）可被抑制。总之，我们的研究结果表明，PPAR信号通路可能是DEN-4改善T2D诱导代谢综合征的靶点。
图7 DEN-4处理对肝脏代谢组学的影响
（A）显著差异代谢物的层次聚类热图（红色表示相对高的表达水平而蓝色表示相对低的表达水平），（B）KEGG富集途径图（气泡颜色越深，代表p值越小，富集度越显著；气泡尺寸越大，代表影响因素越大），（C）所有不同代谢途径的差异丰度得分（根据层次途径分类，较大的点表示更多的代谢物）和（D）肝脏中PPAR-α和PPAR-γ的蛋白质表达，与db/db组相比，*：p<0.05，**:p<0.01，***:p<0.001。
结论
我们目前的研究不仅揭示了肠道微生物群在区分不同来源DEN方面的潜力，还表明DEN对T2D诱导的代谢综合征表现出有益的作用，可能是通过增强db/db小鼠的肠道完整性和通过肠肝轴激活PPAR途径实现的。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37981116/
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