导读
山茱萸，来源于山茱萸果实，是一种广泛使用的中药，在治疗各种慢性肾脏疾病方面具有既定疗效。山茱萸的主要加工形式为生山茱萸（CCF）和酒制山茱萸（WCF）。一般来说，中药往往是经过加工后使用的（炮制）。尽管炮制中药被广泛使用，但到目前为止，大多数中药的潜在炮制机制尚不清楚。在本研究中，我们旨在建立一种将肾脏代谢组学与蛋白质组学相结合的综合策略，并研究了CCF或WCF对慢性肾功能衰竭（CRF）模型的潜在处理机制。首先，我们比较了CCF和WCF对CRF模型大鼠生化参数和病理组织学的影响；然后，基于代谢组学和蛋白质组学技术，筛选CRF模型大鼠给药CCF和WCF后两组之间的组织差异代谢物和蛋白质；同时，采用代谢组学和蛋白质组学相结合的方法来研究与这些标志物代谢产物和蛋白质相关的潜在机制。结果表明，与模型（MG）组相比，我们在CCF处理组观察到27种不同的代谢产物和143种不同的蛋白质，而WCF处理组则具有24种不同的代谢物和379种不同的蛋白。此外，蛋白质和脂质代谢产物的整合相互作用分析显示，WCF和CCF都改善了色氨酸降解和LPS/IL-1介导的维甲酸X受体（RXR）功能抑制。在CRF模型中，WCF通过调节LPS/IL-1抑制RXR功能，且相较于CCF效果更好。实验结果通过qRT-PCR和蛋白质印迹进行了验证。在受WCF影响的8个基因中，FMO3和CYP2E1的基因表达量和蛋白质水平高于CCF的作用。因此，本研究结果为进一步研究不同炮制工艺的山茱萸在CRF中的应用提供了理论依据。研究结果还为分析采用不同炮制工艺的草药在疾病中的作用机制提供了借鉴。
研究热点：
1. 本研究采用了将代谢组学和蛋白质组学方法相结合的综合策略；
2. LPS/IL-1对RXR功能的抑制对于通过调节WCF和CCF通路治疗CRF诱导大鼠至关重要；
3. 通过疾病治疗的差异，探讨酒炮制山茱萸的作用机制；
4. 这种综合策略为解释TCM的处理机制提供了一种新颖而有意义的方法。
论文ID
原名：The therapeutic effect of wine-processed Corni Fructus on chronic renal failure in rats through the interference with the LPS/IL-1-mediated inhibition of RXR function
译名：酒制山茱萸通过干扰LPS/IL-1-介导的RXR功能抑制对大鼠慢性肾功能衰竭的治疗作用
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.4
发表时间：2023.11
通讯作者：杜英峰&孔德志
通讯作者单位：河北医科大学
实验设计
实验结果
1. CCF和WCF对CRF大鼠的肾保护作用
在本研究中，我们评估了WCF和CCF对腺嘌呤诱导的大鼠慢性肾功能衰竭的治疗作用。通过对实验数据的分析，我们得出以下结论。
表1 qRT-PCR引物序列
首先，WCF和阳性对照药物金水宝胶囊（JSB）对腺嘌呤诱导的慢性肾功能衰竭大鼠表现出显著的治疗作用和良好的疗效。WCF和JSB处理后，大鼠的肾功能参数显著改善，包括血清肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）水平降低、尿量增加和尿酸（UA）排泄率提高，WCF和JSB表现出类似的药理作用（图1A）。此外，对大鼠肾组织的组织病理学检查显示，WCF可以减轻肾小球硬化、间质纤维化和炎症等病理变化，从而保护肾脏免受进一步损伤（图1B）。相比之下，CCF的治疗效果相对有限。尽管CCF处理后肾功能参数有所改善，但与WCF相比，改善并不显著。此外，肾组织的组织病理学检查显示，CCF对肾小球硬化和间质纤维化的抑制作用较弱，未能有效缓解肾脏病理损伤。
总之，根据我们的研究结果，与CCF相比，WCF在治疗腺嘌呤诱导的大鼠慢性肾功能衰竭方面表现出了优越的效果。这些发现为进一步探索WCF的潜在临床应用提供了强有力的科学证据，并为制定更有效的治疗策略提供了重要参考。然而，我们仍需要进一步的研究来验证这些结果，确定WCF的适应症和治疗机制，并促进其在临床实践中的应用。
图1 大鼠肾脏生化指标（A）及组织病理学检查（B）。
2. CCF和WCF对CRF大鼠内源性代谢产物的影响
2.1 组织代谢组学概况
对数据集进行主成分分析（PCA），以在得分图上显示组之间的分离趋势。我们建立正交偏最小二乘判别分析法（OPLS-DA）以证明对照组和CRF组之间的代谢差异。基于PCA评分图和OPLS-DA（图2），质控（QC）样品在两种模式下都显示出良好的聚集性，表明色谱分离和质谱采集相对稳定，在样品分析过程中具有良好的准确性和可靠性。R2X和Q2的高值表明PCA和OPLS-DA模型具有合理的解释和预测能力。MG与空白（CG）明显分离，表明腺嘌呤诱导的大鼠动物模型中产生了代谢紊乱。然而，CCF和WCF组的代谢谱更接近CG，而不是MG，这表明CRF模型的代谢谱被CCF和WCF改变了。此外，WCF组比CCF组更接近CG，这表明WCF对腺嘌呤诱导的CRF的代谢紊乱具有更强的调节作用。
图2 代谢组学正离子和负离子模式的PCA评分图（A）；正离子和负离子模式的OPLS-DA评分图（B）。绿色表示CG组。红色表示MG组。黄色表示WCF组。蓝色表示CCF组，天蓝色表示QC组。
2.2 鉴别差异代谢产物
在排除正和负离子模式中的重复值后，有162种生物标志物在CG和MG中表现出不同的水平，当将CCF组与MG和WCF组与MG进行比较时，我们分别鉴定出27和24种相关差异标志物（表2）。为了区分不同组之间的差异代谢物，我们绘制了维恩图（图3A）。通过聚类分析差异代谢物，其水平的变化如热图所示（图3B）。
表2 不同组之间的差异代谢产物
图3 不同组之间差异代谢产物的维恩图（A）；CCF和WCF组中鉴定的差异代谢物的热图（B）。
在CRF大鼠的肾脏中，我们观察到几种维生素水平异常，包括黄素单核苷酸（FMN）和Flvine Mononucleotide。FMN和Flvine Mononucleotide是核黄素的几种形式，FMN参与慢性肾损伤疾病的促炎过程，并通过抑制脂肪酸β-氧化来损害脂质代谢。在本研究中，WCF和CCF显著逆转CRF大鼠肾脏中异常的FMN和Flvine Mononucleotide水平。
与CG相比，我们在MG中观察到磷脂水平异常，包括溶血磷脂酰胆碱（lyso-PC）和溶血磷脂酰乙醇胺（lyso-PE）、磷脂酰胆碱和甘油磷脂酰胆碱。lyso-PC、lyso-PE、磷脂酰胆碱和甘油磷脂酰胆碱水平异常会导致许多代谢途径异常，包括甘油磷酸代谢途径和醚脂代谢途径。Lyso PC参与急性或慢性疾病的促炎过程，磷脂酰胆碱引起强烈的剂量依赖性炎症反应。CCF和WCF处理显著改变了lyso-PC、lyso-PE的水平。
花生四烯酸在细胞信号传导中起着重要的第二信使作用。作为细胞膜脂质的主要成分，花生四烯酸通过磷脂酶A从磷脂中释放，并且在细胞受到应激时是促炎生物活性介质的前体。至少有450种代谢途径（COX途径、LOX途径和CYP1途径）参与花生四烯酸的代谢，花生四烯酸含量的降低可能会影响脂质代谢。此外，减少的花生四烯酸促进炎症。花生四烯酸代谢与肾脏炎症的发生、发展和消退密切相关。在本研究中，CRF大鼠肾脏中的花生四烯酸水平显著降低。CCF和WCF处理减弱了这些异常变化。
图4 蛋白质组学和代谢组学联合途径分析图（A：CCF；B：WCF）；不同组之间的通路影响程度（C）。
3. CCF和WCF对蛋白质水平的调节
3.1 肾蛋白丰度
在这项研究中，我们共鉴定了5719种蛋白质。为了确定各组之间的差异，我们对数据集进行了主成分分析。如图S1A所示，MG和CG明显分离，表明腺嘌呤破坏了CRF模型中的蛋白质表达。CCF和WCF处理大鼠的蛋白质谱比MG更接近CG，表明CRF模型的蛋白质谱被处理破坏。此外，WCF处理组比CCF处理组更接近CG，表明WCF对腺嘌呤诱导的CRF中紊乱蛋白表达的调节作用比CCF效果更强。
蛋白质满足P< 0.05和FC > 2或FC < 0.6被认为是差异表达的蛋白质。当比较CG和MG时，我们鉴定出1247种差异蛋白；当将CCF组与MG以及WCF组与MG进行比较时分别鉴定出143和379种差异表达蛋白。差异表达的蛋白质如维恩图所示（图S1B），其显示与CG相比，CCF组中有143种差异表达的蛋白质，WCF组中有374种差异表达蛋白质。我们通过聚类分析这些差异表达的蛋白质，并显示差异表达蛋白质的热图（图S1C）。差异表达的蛋白质如表3所示。
表3 不同组之间蛋白质的差异
4. 多组学分析确定的代谢途径改变
目前，代谢组学和蛋白质组学在研究中的整合通常依赖于KEGG和GO分析，然而，鉴于蛋白质和代谢物的复杂功能，这在复杂数据集中寻找和过滤无关信息方面提出了重大挑战。此外，GO和KEGG的注释是基于已知的基因和途径信息，这使得如果基因组中存在具有未知功能或新途径的基因，这些工具可能无法提供准确的结果。因此，GO和KEGG的注释可能具有一定的主观性和局限性。相比之下，Ingenuity Pathway Analysis（IPA）软件通过提供更全面、更详细的功能注释和通路分析，在多组学数据集的集成分析方面具有优势。IPA拥有更大的数据库和更广泛的注释信息，可以识别更多的功能和途径相关性。此外，IPA提供了药物靶点预测和生物网络分析等先进功能，使人们能够进一步研究基因和途径的调节机制。
为了评估不同组之间代谢物和蛋白质表达数据的变化，我们基于IPA进行了多组学分析，以探索MG-CG、MG-CCF和MG-WCF中差异积累代谢物（DAMs）和差异积累蛋白（DAPs）之间的相关性。具体细节如图4A和B所示。我们在分析中确定了前15个经典途径，包括LPS/IL-1介导的RXR功能抑制、色氨酸降解III（真核细胞）、EIF2信号传导、酪氨酸降解I、戊二酰辅酶A降解、色氨蛋白降解为2-氨基3-羧基粘康酸6-半醛和外源性物质代谢AHR信号传导途径。这些途径在各组之间的影响程度如图4C所示。为了补充IPA数据库的结果，我们将差异代谢产物和蛋白质输入IMPaLA进行过度表达分析；结果与IPA相似。值得一提的是，我们在之前的研究中发现了色氨酸降解III（真核生物）中某些靶点的验证。
通过对相关文献的回顾，我们发现LPS/IL-1介导的RXR功能信号通路的抑制与炎症的发展密切相关。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的主要促炎成分，可诱导白细胞介素（IL）-1和肿瘤坏死因子mRNA的表达，从而诱导炎症反应。LPS增加IL-1-β、IL-6和IL-8的分泌。IL-1增加LPS刺激的星形胶质细胞分泌的肿瘤坏死因子-α，导致炎症。LPS/IL-1介导的RXR功能抑制是一种核糖体信号传导和病原体影响的信号传导途径，主要影响脂质代谢、小分子生物化学和分子转运。维甲酸X受体（RXRs）是通过基因激活介导维甲酸生物学效应的核受体。RXRα是II型核受体的二聚化伴侣，促炎细胞因子信号传导导致JNK介导的核输出（依赖于CRM-1），使核RXRα水平降低，核DNA结合和转录活性降低。相反，肝转运蛋白（ABC、OATP、MDR1、NTCP）、代谢酶（CYP、GST、UGT、SOD）和生物合成酶（CYP7A1）的表达减少会导致脂质、胆固醇、胆汁酸和外源物质的代谢、转运和/或生物合成受损。CRF的发展和炎症的发展有着密不可分的关系。因此，LPS/IL-1介导的RXR功能信号通路的抑制可能是WCF和CCF改善CRF的关键通路。表4列出了本研究中与LPS/IL-1介导的RXR功能抑制相关的蛋白质。
表4 LPS/IL-1介导的RXR功能相关蛋白的抑制作用
5. 差异基因表达的测量
我们评估WCF和CCF对表4中蛋白质编码基因的影响，通过qRT-PCR确认差异表达的mRNA。在CRF模型中，FMO1、FMO3、CYP2E1、CAT和ACOX1的表达水平上调，GSTA1、SLC27A2和CYP4A14的表达水平下调（图5A–H）。CCF和WCF处理后，GSTA1、SLC27A2、FMO1、FMO3、CYP4A14、CYP2E1、CAT和ACOX1的表达水平发生不同程度的逆转。与CCF相比，WCF对GSTA1、FMO1、FMO3和CYP2E1的影响更强，CCF对SLC27A2、CYP4A14、CAT和ACOX1表现出更强的调节作用。尽管CCF和WCF都能调节SLC27A2和ACOX1的表达，但CCF组和WCF组之间的表达水平没有显著差异（P > 0.05）。
图5 CCF和WCF对FMO1（A）、GSTA1（B）、CAT（C）、CYP2E1（D）、SLC27A（E）、CYP4A14（F）、FMO3（G）和Acox1（H）表达的影响。
临床研究表明，FMO3将TMA代谢为TMAO。慢性肾脏疾病的进展与TMAO的升高呈正相关。FMO3表达和TMAO合成的抑制减轻了与小鼠蛋白质超负荷肾病相关的肾脏恶化。CYP2E1参与许多低分子量物质的代谢活化。CYP2E1的诱导可能是遗传多态性的结果，是导致某些化学致癌过程发展的第一步。HNF-1a与CYP2E1启动子结合导致肾损伤和CYP2E1表达升高。CYP2E1与浸润性单核细胞和Treg水平密切相关，并参与与肿瘤免疫微环境相关的脂质代谢和铁死亡。谷胱甘肽S-转移酶是一种诱导型酶，催化反应性亲电试剂和氧化剂的解毒作用，以防止肿瘤转化。谷胱甘肽S-转移酶A1-1的半衰期相对较短（1 h），更具特异性，在炎症引起的器官损伤后迅速释放到血液中。谷胱甘肽转移酶A1表达的下调保护细胞免受炎症过程中产生的脂质过氧化有毒副产物的影响。上调SLC27A2可显著抑制肾癌症细胞系的增殖、迁移和侵袭，SLC27B2可通过负调控CDK3影响上皮-间质转化（EMT）信号通路，抑制肾癌症细胞系的增生。EMT与癌症的进展和转移有关。酰基辅酶A氧化酶1（ACOX1）是H2O2的主要产生者，是过氧化物酶体β-氧化的限速酶，在介导哺乳动物炎症反应和活性氧代谢中起着关键作用。ACOX1蛋白的下调减少了过氧化物酶体的数量，并增加了抗氧化基因的mRNA表达，以抑制炎症。CYP4A14属于脂解基因，CYP4A14的上调会增加血压和蛋白尿，导致炎症。FMO1是一种肝外药物代谢酶，在人类肾脏中以显著水平表达。FMO1可能是代谢清除的重要因素。过氧化氢酶（CAT）是一种酶促清除剂，可将H2O2分解为分子氧和水，是生物防御系统的关键酶之一。CAT表达下调可减少肾损伤引起的炎症和氧化损伤。
在本研究中，qRT-PCR实验结果显示，WCF和CCF对FMO3和CYP2E1基因的表达表现出显著的调节作用，超过了它们对其他基因的影响。因此，我们推测FMO3和CYP2E1可能是WCF和CCF对抗CRF的重要靶点。
6. FMO3和CYP2E1表达的测定
二甲基苯胺单加氧酶（A0A0G2JSI0）和细胞色素P450 2E1（A0A0G2 K5X9）的这些差异蛋白分别由FMO3和CYP2E1编码。免疫印迹法用于验证FMO3和CYP2E1的表达。如图6所示，在CRF大鼠的肾脏中，FMO3和CYP2E1的表达水平显著增加。结果表明，WCF和CCF通过抑制FMO3和CYP2E1的表达而发挥抗CRF作用。相反，CCF和WCF处理显著减弱腺嘌呤诱导的FMO3和CYP2E1的过度表达。WCF对FMO3和CYP2E1表达水平的影响大于CCF。结果提示甲基苯胺单加氧酶和细胞色素P4502E1可能是治疗CRF的靶点。
图6 FMO3和CYP2E1在不同组之间的蛋白质表达
结论
本研究旨在探讨山茱萸治疗慢性肾功能衰竭的作用机制。我们建立了代谢组学和蛋白质组学相结合的综合方法，并用于比较CCF和WCF改善CRF大鼠的差异。LPS/IL-1介导的RXR功能抑制可能是治疗慢性肾功能衰竭的关键途径。我们采用综合分析法确定关键靶点，结果表明WCF治疗CRF的疗效优于CCF；我们筛选出FMO3和CYP2E1作为关键靶点，WCF在调节这些靶点方面优于CCF。该研究不仅为进一步研究不同炮制工艺的山茱萸的作用机理提供了基础，而且有助于山茱萸作为CRF治疗药物的应用。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378874123013818
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