摘要
干眼病(DED)是一种多因素的眼表疾病，炎症起着重要的病因作用。小檗碱(BBR)已显示出治疗炎性疾病的疗效。然而，BBR对DED的治疗效果尚无足够的相关信息。此研究旨在检测BBR对DED的影响并探讨其可能的机制，研究内容包括体外、体内研究和网络药理学分析。用不同浓度的BBR评价人角膜上皮细胞(HCE)活力；采用干燥应激法建立小鼠干眼症模型，外用环孢素(CSA)、BBR滴眼液或赋形剂给药7天；通过酚红棉试验、俄勒冈绿葡聚糖(OGD)染色和周期性酸希夫(PAS)染色，评价治疗后的干眼情况。定量观察大鼠眼表炎症及细胞凋亡水平，从数据库中收集与小檗碱和干眼症相关的潜在靶点。通过STRING数据库、metscape平台和Cytoscape软件实现蛋白-蛋白相互作用网络分析和GO & KEGG富集分析，寻找核心靶点和信号通路。采用Schr¨Odinger软件进行分子对接，PyMOL软件进行可视化。最后，检测PI3K/AKT/NFκB和MAPK通路的水平。结果表明，BBR对高渗条件下HCE损伤有一定的挽救作用，同时可改善干眼症。BBR滴眼液对结膜炎症因子及CD4+T细胞浸润有抑制作用。此外，BBR滴眼液通过避免严重的眼表细胞凋亡，降低MMP-3和MMP-9的水平来保护眼表细胞。网络药理学分析发现BBR与干眼症有148个共同靶点相交。通过PPI和GO&KEGG富集分析鉴定核心蛋白和核心通路。分子对接显示出BBR与这些核心靶点的良好结合。最后，体内研究证实BBR滴眼液通过抑制PI3K/ AKT/NFκB和MAPK通路对干眼症有治疗作用。本研究为BBR作为治疗干眼症的候选药物提供了有力证据。
研究背景
干眼症(DED)是一种复杂的多因素眼表疾病，具有多种症状。随着电子产品的广泛使用，DED成为严重的公共卫生问题，造成了巨大的经济负担。根据不同的调查结果， DED的患病率存在相当大的差异，全球患病率从4.1%到23.7%不等。DED降低了视觉功能，严重影响了个体的生活质量。
DED的核心病理机制表现为泪液高渗，引起眼表一系列事件，最终导致慢性角膜上皮损伤和炎症。炎症在眼表慢性损伤中起着重要作用，并促进泪膜稳态的丧失，形成恶性循环。DED诱导T细胞介导的免疫反应导致炎症介质募集到眼表，炎症在DED发病过程中的重要性反映了有效、安全的抗炎治疗是治疗效果满意的前提。目前有几种免疫抑制疗法，包括局部使用糖皮质激素和非糖皮质激素免疫调节剂。免疫抑制疗法在缓解疾病方面有一定的作用，但目前可用的药物仍有一定的局限性。他克莫司(又名FK506)滴眼液被广泛用于DED，它可以阻断T淋巴细胞活性，改善干眼症。然而，一些患者，特别是轻度患者，反映使用后有烧灼感。此外，他克莫司很难溶解在亲水性溶液中，这也可能影响效果。
药用植物的天然化合物近年来越来越多的研究集中在抗炎作用上，作为候选药物使用，并且显示出较少的副作用。从黄连、水螅等中草药中提取的小檗碱( BBR)可用于治疗腹泻或胃肠道疾病。近年来，它在抗肿瘤、调节脂质代谢，甚至在抗糖尿病方面也发挥了作用。随着研究的深入和发展，BBR在非特异性关节炎(AA)等自身免疫性疾病中的免疫调节作用已被报道。在眼科领域，有报道称BBR通过下调MAPK通路调节ARPE-19细胞中炎症因子的释放。此外，BBR可通过调节NFκB通路抑制细胞凋亡，从而抵抗糖尿病视网膜病变。BBR还通过加强自噬和激活AMPK/mTOR通路来保护Müller细胞免受高糖的影响。然而，BBR对DED的药物作用尚无足够的相关信息。
网络药理学通常通过构建“疾病-基因-靶点-药物”网络来预测药物的靶点。它已被证实是一种有用的生物信息学工具，可以收集几乎所有生物活性成分的潜在靶点来治疗疾病，并发现核心靶点和信号通路，这是一种通往多靶点药物治疗靶点的有效途径。
考虑到DED的病理机制和BBR的免疫调节剂，可以假设BBR可以缓解DED，通过体内和体外实验评估BBR的治疗效果。此外，考虑到小檗碱可能具有多个靶点，通过网络药理学、分子对接和动物蛋白水平试验进行验证。本研究结果表明，BBR可作为一种新的治疗DED的药物，通过调节PI3K/AKT/NFκB和MAPK通路，改善DED的凋亡和炎症。
文章内容
1. 小檗碱可挽救高渗条件下的细胞损伤
小檗碱的三维结构如图1A所示。数据表明，在小檗碱浓度超过20μM时，作用12 h(图1B)和24 h(图1C)后，HCE细胞的活力均受到抑制。而小檗碱浓度在1.25 μM ~ 10 μM范围内作用24 h后，HCE细胞的活力显著提高。此外，采用高渗(HS)培养基培养HCE细胞24 h，模拟DED条件。HS作用下细胞活力明显下降，2.5 μM和5 μM浓度的小檗碱均能显著提高细胞活力(图1D)，说明小檗碱对HS作用下的细胞损伤有修复作用。
图1.小檗碱提高了高渗条件下的细胞活力。
2. 小檗碱滴眼液用于干眼症动物的评价
为评价小檗碱的作用，建立干眼动物模型，持续7 d (干燥应激7 d；DS7)。角膜上皮染色、泪液生成测量和结膜杯状细胞计数是评估干眼病的重要指标。在干眼动物模型中，常涉及酚红线试验、OGD染色和PAS染色。与CTRL组(正常小鼠为阴性组)相比，DS7组泪液分泌明显下降，而局部使用CSA、LC-BBR和HC-BBR滴眼液比对照组明显改善泪液分泌(图2A)。如图2B和图2C所示，DS7组与其他组相比，角膜OGD染色明显增加。经CSA、LC-BBR、HC-BBR滴眼液治疗后，OGD染色明显降低。LC-BBR减轻了OGD染色，但仍存在小浓度区上皮缺陷(图2B)。此外，CSA、LC-BBR和HC-BBR滴眼液与载药组相比，均能恢复结膜杯状细胞的数量(图2D和E)。
图2.小檗碱滴眼液用于干眼模型的评价。
3. 小檗碱滴眼液可减轻眼表细胞凋亡
无论是DS7组还是VEHICLE组，结膜上皮和角膜上皮均出现病变，炎症细胞浸润，而CSA、LC-BBR和HC-BBR滴眼液对小鼠均有明显改善(图3A)。Cleaved caspase 3和Cleaved caspase 8被认为是凋亡过程中重要的末端剪接酶，CSA、LC-BBR和HC-BBR滴眼液降低了结膜中Cleaved Caspase 3或Cleaved Caspase 8的荧光强度(图3B、3D和3E)和蛋白水平(图3H、3I和3J)，与载药组相比，差异有统计学意义。结膜上皮和角膜上皮TUNEL染色显示，CSA、LC-BBR和HC-BBR滴眼液对角膜细胞凋亡水平的控制优于对照组(图3C、3F和3G)。总体而言，BBR滴眼液通过减少细胞凋亡来保护眼表。
图3.小檗碱滴眼液可减轻眼表细胞凋亡。
4. 小檗碱滴眼液增强角膜屏障功能，降低DS引发的炎症
本研究还研究了表现角膜上皮屏障功能的MMP-3或MMP-9。CSA、LC-BBR和HC-BBR滴眼液抑制角膜上皮免疫荧光染色检测DS产生的MMP-3 (图4A)和MMP-9 (图4C)，CSA、LC-BBR和HC-BBR组与VEHICLE组比较，MMP-3 (图4B)或MMP-9 (图4D)的荧光强度有统计学差异。此外，通过检测MMP-3和MMP-9的蛋白水平(图4G)来验证免疫荧光染色的趋势。结果显示，BBR降低了角膜上皮中MMP-3 (图4H)和MMP-9 (图4I)，且具有统计学意义。CD4+ T细胞染色图像显示，DS导致结膜内CD4+ T细胞浸润增加(图4E和4F)。CSA、LC-BBR、HC-BBR滴眼液均能抑制结膜内CD4+ T细胞浸润。总之，BBR滴眼液能有效抗DS引起的角膜损伤和炎症。
图4.小檗碱滴眼液增强角膜屏障功能，降低DS引发的炎症。
5. 小檗碱和干眼症的靶点
为了进一步研究BBR滴眼液治疗干眼症的作用机制，采用网络药理学方法。利用5个数据库收集小檗碱的靶点。其中TCMSP数据库16个，STITCH数据库10个，PharmMapper数据库219个，Swiss TargetPrediction数据库105个，Genecards数据库263个。去除重复数据后，共收集到521个小檗碱靶点(图5A)。去除重复数据后，从5个数据库中共识别出1275个干眼靶点(图5A)。其中，OMIM靶点197个，Drugbank靶点77个，TTD靶点5个。DisGeNET数据库剔除重复后共发现220个靶点，其中干眼综合征靶点156个，干眼症角膜结膜炎靶点90个，干眼症靶点149个。从Genecards数据库中鉴定出3687个蛋白靶点，筛选后的潜在靶点只有925个，相关性评分大于5.2。在线平台绘制的维恩图显示了小檗碱和干眼症的148个共同靶点(图5B)。利用Cytoscape v.3.9.0软件将小檗碱和干眼症的靶点以药物-靶点-疾病网络的形式可视化。148个常见靶点用粉色表示，其他靶点用蓝色表示(图5C)。
图5.小檗碱和干眼症的靶点。
6. 网络构建与分析
利用核心靶点、蛋白-蛋白相互作用(PPI)数据、GO功能和KEGG通路富集数据构建靶点-靶点网络(或称PPI网络)和药物或疾病-靶点路径网络。使用STRING数据库组成PPI网络，置信分数中等，为0.400，如图6A左侧网络所示。结果得到145个节点和3022条边。节点平均度达到41.7。这些数据被输入到Cytoscape软件中进行进一步分析。如图6A右侧网络所示，节点大，填充颜色深，表明该网络中靶点相互作用强，因此AKT1、ALB、TNF、INS、IL6和TP53在小檗碱和干眼症的共同靶点中至关重要。采用MCODE算法对目标的不同功能模块进行识别，设置节点得分cut = 0.1，K-Core = 2。共获得4个簇(图6B)。每个簇中的靶点相互作用，共同参与一些复杂的生物学功能。
利用metscape平台分析了小檗碱和干眼症148个共同靶点的GO功能和KEGG通路富集数据。图6C显示了148个常见靶点的前20个分子功能(MF)、细胞成分(CC)和生物过程(BP)。靶点的分子功能主要集中在磷酸转移酶和激酶活性方面。此外，蛋白磷酸化、激酶活性和MAPK级联的调控在靶点的生物学过程中至关重要。同时，通过KEGG富集分析获得188条通路。图6D显示了前20条通路，包括PI3K-Akt通路、MAPK通路等。
将小檗碱和干眼症的共同靶点、PPI数据和KEGG富集分析数据导入Cytoscape v.3.9.0，建立一个药物或疾病-靶点路径网络。药物、疾病、靶点和通路分别用黄色、橙色、粉色和蓝色表示(图6E)。核心靶点包括MAPK1、PIK3CA、PIK3R1、MAPK2K1、AKT1、NFKB1、TNF和通路包括PI3K-AKT通路、MAPK通路和肿瘤通路，选择并显示在该网络的中心。
图6.网络建立和分析。
7. 分子对接
为了进一步验证小檗碱与干眼症部分核心靶蛋白的结合能力和结合方式，利用Schr¨Odinger和PyMOL软件进行分子对接。选择PIK3R1、PIK3CA、AKT1、MAP2K1、MAPK1和TNFA作为对接受体，以小檗碱为配体。从图7A可以看出，小檗碱可以很好地封装在核心靶点的结合口袋中，与PIK3R1、PIK3CA和TNFA形成3个氢键相互作用，与AKT1、MAP2K1和MAPK1形成1个氢键相互作用。图7B中的GlideScore显示了小檗碱与TNFA (GlideScore =-9.851)、PIK3CA (GlideScore =-8.116)或MAP2K1之间的强结合(GlideScore = -7.257)。
图7.小檗碱与干眼症核心治疗靶点的分子对接。
8. 小檗碱滴眼液减轻了干眼症的炎症
为了进一步验证网络药理学和分子对接的分析结果，进行了分子生物学实验。综上所述，HC-BBR滴眼液(2 mg/ml)可作为后续实验的最佳浓度。采用qPCR和Western Blot检测结膜炎症因子。在DED相关炎症因子中(图8A)， DS7组小鼠结膜中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-17、IFN-γ和TNF-α的基因表达水平较CTRL组显著上调(图8B)，而IL-8、IL-10和IL-13的基因表达水平无显著差异。此外，Western Blot进一步检测DS7组结膜IL-1β、IL-6、IL-17和TNF-α蛋白水平较CTRL组显著升高(图8C和8D)。此外，与对照组相比，BBR滴眼液治疗7 d后结膜内炎症因子基因和蛋白水平明显降低。
图8.小檗碱滴眼液可减轻眼表炎症。
9. 小檗碱滴眼液通过PI3K/AKT/NFκB和MAPK通路改善干眼症
为了验证BBR滴眼液治疗DED的潜在调控策略，检测了MAPK、PI3K/AKT/NFκB通路相关的关键蛋白水平。值得注意的是，P65通过NFκB通路进入核内，成为这些信号通路激活的重要特征。图9A和图9B显示，DS组结膜细胞质中AKT、IKK和NFκB的磷酸化水平较CTRL组明显上调。然而，与VEHICLE组相比，接受BBR滴眼液的小鼠这些蛋白的磷酸化水平明显降低。此外，BBR还能显著抑制DS诱导的P65核易位。此外，BBR降低了DS刺激的ERK和P38磷酸化水平(图9C和9D)。通过免疫荧光染色进一步检测NFκB蛋白向细胞核转运的情况，发现BBR处理后NFκB的细胞核染色降低(图9E)。目前的研究结果表明，BBR抑制PI3K/AKT/NFκB和MAPK通路，改善DED。
图9.小檗碱滴眼液通过抑制PI3K/AKT/NFκB和MAPK通路改善干眼症。
总结与讨论
综上所述，BBR通过调节PI3K/AKT/NFκB和MAPK通路，改善小鼠干眼症的炎症和细胞凋亡。本研究证实了BBR对干眼症的治疗作用及其可能的机制，因此，BBR可能是治疗干眼病引起的眼表疾病的候选药物。
转自：Ocular Biomaterial Team
转自：“如沐风科研”微信公众号
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