大家好，今天我给大家分享的是由吉林农业大学中医药学学院沈琼2023年发表在Food&Function上的文章，题目是“桔梗素D改善HFD/STZ诱导的2型糖尿病小鼠的高血糖和肝脏代谢紊乱”
文献链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36504256/
实验背景
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桔梗(PG)是我国传统中草药，广泛用于治疗咳嗽、哮喘、结核病等呼吸系统疾病。近年来研究表明，PG具有多种药理活性，包括抗炎、抗肥胖、降低胆固醇、降低血糖和抗氧化应激作用等。桔梗素D(PD)是从PG根中分离出来的三萜皂苷，具有较强的药理活性。PD可以通过AMPK信号通路调节高脂饮食诱导的肝脏脂肪生成，同时降低血清甘油三酯水平。但是PD是否对T2DM有影响及其作用机制尚未得到证实。
文章亮点：本实验通过构建T2DM小鼠模型来研究PD对糖脂代谢的调节作用，基于AMPK介导的糖脂代谢途径研究其作用机制(二甲双胍作为治疗T2DM的阳性药)。
实验内容
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PD的制备与分析
桔梗晒干后粉碎，用70%乙醇以20：1的液料比室温下超声提取两次，合并提取液后浓缩成浸膏1。浸膏1过AB-8大孔树脂，吸附12h，用蒸馏水、30%乙醇和50%乙醇洗脱，将50%乙醇洗脱的部分浓缩为浸膏2，浸膏2过硅胶得到粗产物，粗产物用C18色谱柱进行制备液相色谱纯化，纯度达到98%以上。离心浓缩，冻干制备粉状PD。
液相条件：流动相为乙腈(A)和水(B)，采用梯度洗脱：0-30 min，18.0–25.0%A；30-60 min，25.0–27.0%A；60-70 min，27.0–27.0%A；70-71 min，27.0-18%A，流速为1.0 mL/min。
实验设计
8周龄雄性C57BL/6小鼠50只随机分为对照组(=10)和高脂饲料组(=40)，对照组喂食正常饲料，高脂饲料组连续喂食高脂饲料。喂养11周后，单次腹腔注射链脲佐菌素(100mg kg−1)诱发糖尿病。5周后，当血糖稳定下来后，用血糖测试仪进行测量。如果FBG水平达到或超过7.8 mmol L−1，则认为该动物为糖尿病。
HFD组小鼠分为4组，T2DM模型组灌胃正常蒸馏水(n=10)，阳性对照组灌胃二甲双胍200mgkg−1(n=10)，低剂量组灌胃PD2.5mg kg−1(n=10)，高剂量组灌胃PD5.0mg kg−1(n=10)。PD治疗8周后处死小鼠采集血液样本和肝组织，同时称重，计算肝脏指数。部分肝脏置于10%中性缓冲福尔马林中，一些用石蜡包埋，一些用OCT包埋，进行组织病理学观察和免疫荧光分析。其余肝组织新鲜液氮冷冻，−80°C保存。
实验结果
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1、PD对T2DM小鼠体重、血脂、FBG水平、葡萄糖耐受不良和胰岛素抵抗的影响
由于饮食不同，对照组小鼠的体重显著低于T2DM组，随着给药时间的增加，PD给药组的体重低于T2DM模型组，阳性对照组也较低。如下图a。
实验结果表明T2DM模型组小鼠的血清TG、TC和LDL-C水平高于对照组小鼠。经PD处理的T2DM小鼠的TG和LDL-C水平显著下降(p<0.05)，PD组(2.5mg kg−1)组的治疗趋势优于PD组(5mg kg−1)组。如下图b、c、d。
T2DM模型组的FBG值高于对照组，PD低剂量组FBG稳定在13.9mmol，和PD高剂量组FBG稳定在12.6mmol，虽然没有达到阳性药12mmol治疗水平，但是与模型组16.7mmol相比有很大改善。如图e所示。为了检测PD对胰岛素抵抗水平的影响，我们使用HOMA-IR来量化胰岛素抵抗。PD组的平均HOMA-IR评分低于模型组，但仍高于对照组，如下图f。
OGTT结果显示，模型组小鼠灌胃葡萄糖后血糖水平迅速升高，在达到最高水平后，下降速度比其他组要慢，如下图g。
ITT是另一种评价胰岛素抵抗的方法。在ITT进展过程中，模型组的初始血糖浓度高于其他组，胰岛素注射后血糖水平迅速下降，1h后下降速度慢于其他组，如图i所示。在AUC测量中，PD给药组和阳性对照组均低于T2DM模型组，如下图j，PD治疗改善了T2DM小鼠的胰岛素抵抗。
2、PD对T2DM小鼠肝损伤和肝脂肪变性的影响
称量小鼠肝脏的重量，进行指标分析。由于对照组和T2DM模型组的饮食处理不同，模型组的肝脏指数明显高于对照组。PD(2.5和5mg kg−1)组的肝脏指数低于模型组，PD(2.5mg kg−1)组的肝脏指数更接近正常组（如下图a）。
与对照组相比，HFD/STZ干预后的小鼠血清ALT和AST水平显著升高(p<0.01),成功建立了T2DM诱导的肝损伤小鼠模型。而PD给药组和阳性对照组的血清ALT和AST水平均低于模型组(p<0.01)。实验结果表明PD可改善T2D诱导的肝损伤。
H&E染色结果显示，对照组的肝组织细胞排列有序，细胞形态正常，细胞质丰富，边界清晰。而T2DM模型组则表现出明显的肝病理改变例如脂质液泡、脂肪变性和细胞炎症浸润。PD给药组可以缓解其肝病变。
采用PAS染色法评估糖原在肝脏中的分布。结果显示，与对照组相比，T2DM模型组小鼠肝糖原分解严重，PD给药8周后缓解这种情况。
4、PD对T2DM小鼠肝脏糖异生途径的影响
肝脏是体内血糖和脂肪酸代谢中心，对碳水化合物的代谢起着重要作用，调节机体内的糖异生，负责调节血糖的平衡。糖异生是从肝脏或肾脏中的乳酸、氨基酸和甘油产生葡萄糖的重要途径，确保血糖水平的稳态，其发生受到胰岛素和胰高血糖素的调节，也受到一系列转录因子的调节，这些转录因子向糖异生的两个关键限速酶：G6Pase和PCK1提供信号。这两个关键限速酶的表达可以促进糖异生的发生。如下图所示促进AMPK的磷酸化，降低PGC-1α、PCK1和G6Pase的表达可以改善糖尿病小鼠的肝脏过度糖异生状态。
如下图所示，PD激活AMPK，抑制G6Pase和PGC-1α的过表达水平，也可以PCK1的表达水平，最终改善由HFD/STZ引起的过度糖异生和脂质代谢紊乱的情况。
如下图所示，通过免疫印迹法检测了AMPK/ACC/CPT-1脂肪酸合成代谢途径中各蛋白的表达情况。在T2DM状态下，AMPK磷酸化水平的降低可以降低ACC磷酸化的表达。结合光密度整合的结果可以看出，PD给药可以促进ACC的磷酸化，促进CPT-1的表达，即PD给药可以减少脂肪酸的合成和摄取，促进脂肪酸的氧化。
综上实验证明，PD在HFD/STZ诱导的T2DM小鼠肝脏中调节糖脂代谢紊乱的作用机制与AMPK/PCK1/G6Pase糖异生途径和AMPK/ACC/CPT-1脂肪酸代谢途径密切联系。
转自：“如沐风科研”微信公众号
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