NAR | 中国科学技术大学鲍坚强课题组揭示精氨酸甲基转移酶Prmt1协调精原稳态和雄性生育能力所必需的种系精氨酸甲基化组

不孕不育已成为全球 10～15% 育龄夫妇日益关注的生殖问题。在整个发育过程中，雄性生殖细胞的生长受到时空控制。在精原细胞的增殖和分化、减数分裂和减数分裂后单倍体种系发育过程中，哺乳动物的雄性生殖细胞经历显着的形态变化和染色质修饰。截至目前，研究表明，种系发育任何时刻的干扰都可能引发不孕。表观遗传改变在生殖细胞发育过程中经历本质重塑。在大多数情况下，异常的表观遗传改变会导致生殖细胞损失和生殖问题。精氨酸甲基化是一种常见的翻译后修饰，与多种生物活性的调节相关。精氨酸甲基转移酶 1 (Prmt1) 与减数分裂期间生殖细胞的发育有关。然而，由于其在null小鼠中的早期胚胎致死性，表现出自发性 DNA 损伤、细胞周期延迟和checkpoint激活缺陷，因此其在体内生殖细胞发育早期阶段的作用尚不清楚。

2023年9月22日，中国科学技术大学附属第一医院、生命科学与医学部鲍坚强课题组在Nucleic Acids Research上发表题为“The argininemethyltransferase Prmt1 coss the germline argininemethylome Essential for sermatogonial homeostasis andmale professionalty”的论文。论文共同第一作者为巴基斯坦留学生Muhammad Azhar和博士研究生徐曹玲。

在这项研究中，作者发现在小鼠精子发生过程中，Prmt1 主要分布在精原细胞核中，但在精母细胞中分布较弱。通过利用三种 Cre 介导的 Prmt1 敲除小鼠系的组合，他们揭示了 Prmt1 对于精原细胞的建立和维持至关重要，并且 Prmt1 催化的不对称甲基精氨酸协调精原细胞内固有的转录稳态。结合高通量 CUT&Tag 分析和改进后的微量Smart-seq2 分析，作者揭示了 Prmt1-deposited H4R3me2a 标记在启动子和外显子/内含子区域被富集，并在小鼠精原细胞中塑造了独特的转录组全貌以及选择性剪接模式。总的来说，他们的研究提供了遗传和机制证据，将 Prmt1-deposited甲基精氨酸信号传导与在哺乳动物种系中协调精原细胞发育的高保真转录组同一性的建立和维持联系起来。

Prmt1 活动促使其他 PRMT 成员的 MMA 和 SDMA 全球水平显着提高。他们使用三种泛甲基精氨酸抗体（MMA、ADMA 和 SDMA）对 P8（以精原细胞为主）和 P17（精母细胞）收集的 Prmt1-sKO 睾丸裂解物进行了免疫印迹。这些抗体是使用共有基序中含有甲基化精氨酸残基的短肽混合物生成的，并与相应的甲基精氨酸发生免疫反应。与之前在体细胞中的研究一致，他们发现 MMA 水平显着增加，SDMA 甲基化适度增强，这表明 Prmt1 和睾丸中其他 PRMT 成员之间存在底物串扰。然而，令人惊讶的是，他们发现 ADMA 水平也显着上调，尤其是在 P8 睾丸中。Prmt1 在所有组织中普遍表达。

他们进一步发现，即使在成年小鼠中，Prmt1-uKO 系中的整体 KO 也会导致小鼠快速死亡（Tam 注射后 9-15 天）。为了追踪底物甲基化的动态并排除 Prmt1-uKO 中观察到的间质细胞的影响，他们在 Tam 注射后四次时间点：P16、P18、P20和P22，对 Tam 诱导的 Prmt1-dKO 睾丸中的所有三个甲基精氨酸进行了时间过程测量。为了支持上述发现，虽然底物 SDMA 水平与其他 MMA 和 ADMA 标记相比不太强，但在 Prmt1-dKO 睾丸中tamoxifen诱导的 Prmt1 缺失后，所有三种甲基精氨酸水平都明显增强。这些数据表明，Prmt1 活性改变了胚系中三种甲基精氨酸类型之间以及 I 型不对称二甲基化内复杂的底物串扰。

为了探究 Prmt1 缺失如何在转录组水平上影响精原细胞，他们接下来使用整个小鼠睾丸或纯化的小鼠精原细胞进行 RNA 测序。使用 P7 时整个小鼠睾丸的传统批量 RNA 测序鉴定出大量失调基因。因此，为了捕获准确的转录组变化，他们进一步使用来自 P7 睾丸FACS 分选的 EGFP 阳性精原细胞进行了 mini-Smart-seq2 分析，该分析专门针对低输入细胞样本（范围从 ~10,000–100,000）进行了优化。一致地，这揭示了 1231 个上调基因和 660 个下调基因。已知 PRMT 酶通过甲基化剪接因子（例如 SmB 和 hnRNP 成员）来影响选择性剪接。因此，他们分析了选择性剪接（AS）事件，并发现了大量的选择性剪接群体。总之，这些证据表明 Prmt1 保持了精原细胞发育所必需的转录组高保真度。

Prmt1-deposited不对称 H4R3 甲基化 (H4R3me2a)，被称为基因表达的活性组蛋白标记。为了探索 Prmt1 丢失导致转录组失调的机制，他们尝试执行 Henikoff 实验室最近开发的高度灵敏且高效的 CUT&Tag 分析。引人注目的是，所有五个组蛋白精氨酸甲基标记（H4R3me2a、H3R2me2a、H4R3me2s、H3R8me2a、H4R3me1）在 TSS 区域高度富集，尽管与 TSS 区域的 H3K4me3 峰相比峰密度低得多。这表明 PRMT 成员能够通过在基因启动子处-deposited组蛋白甲基精氨酸标记来直接调节基因表达。接下来，他们观察 IGV 浏览器中是否存在一组对精原细胞发育至关重要的转录因子，这些转录因子在 Prmt1 丢失后表现出下调表达。它们可分为SSC自我更新、SSC自我更新促进和精原细胞分化促进转录因子三类。

IGV 轨迹总共包含五个甲基精氨酸标记以及两个众所周知的活性标记（H3K4me3 和 H3K27ac）作为阳性对照和用于启动子识别。这项广泛的筛查表明，为了支持下调的 mRNA 水平， P7睾丸三种 SSC 自我更新转录因子（Bcl6b、Id4、Lhx1 和 Pou3f1）的抑制性 H4R3me2s 峰值强度在 Prmt1-dKO 的 TSS 区域显着升高。相比之下，Etv5 TSS 区域的 H4R3me2s 峰值富集没有差异，这表明 WT 和 Prmt1-dKO 睾丸之间的 mRNA 表达水平相当。对三个 SSC 自我更新促进转录因子（Pou5f1、Zbtb16 和 Taf4b）和精原细胞分化促进转录因子（Sohlh2）的进一步检查也支持这样的观点，即在启动子处Prmtl损失后H4R3me2s的重新占据至少部分地解释了对维持精原细胞稳态至关重要的基因的下调的mRNA水平。总之，这些证据表明 Prmt1-deposited的 H4R3me2a 本质上与 H4R3me2 竞争，以建立协调精原细胞自我更新和分化的转录组同一性。

雄性生育能力的维持取决于持续的精子发生，这是通过哺乳动物睾丸中高度异质的精原细胞群体的及时自我更新和协调分化编程来建立和维持的。在此，他们确定了一个核心表观遗传因子，即 Prmt1，它是协调精原细胞发育所必需的，通过(i)控制与精原细胞自我更新和分化相关的种系转录因子的基因表达；(ii)通过将H4R3me2a-deposited在基因启动子处来调节剪接相关因子的表达；(iii) 通过在外显子区域描绘 H4R3me2a 标记来微调选择性剪接。这项研究提供了遗传和分子证据，将 Prmt1-deposited甲基精氨酸信号传导与指导哺乳动物种系精原细胞发育的高保真转录特性的建立和维持联系起来。

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https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkad769/7280548

转自：“iNature”微信公众号

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