NAR | 利用源自最小前体的人工microRNA在植物中实现无转基因、基于病毒的基因沉默

MicroRNA(miRNA)是一类20-24核苷酸(nt)内源性小RNA(sRNA)，在植物和动物中通过转录后抑制基因表达。大多数植物miRNA长度为21 nt，并调节影响生长、发育、逆境适应或激素调节等关键生物过程的转录因子和蛋白质编码基因表达。植物MiRNA的生物发生完全发生在细胞核中，并通过RNA聚合酶II转录MIR基因开始，导致大型初级MiRNA前体(或pri- MiRNA)的合成，这些前体在长度(从数百到数千个核苷酸)和二级结构上高度可变。

Pri-miRNAs被加帽的、剪接的和多聚腺苷酸化，并且具有特征性的折叠(或发夹)结构，其长度也不同(从50到900nt)。MiRNA折叠有一个共同的结构，由一个15–17碱基对(bp)的基干(BS)、一个miRNA/miRNA*双链体和一个大小和形状可变的远端茎环(DSL)区域组成，两侧是单链RNA (ssRNA)片段。大多数pri-miRNA的加工通过“碱基对环”机制发生，其中与其辅助蛋白SERRATE (SE)和HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1)相关的核RNase III DICER-LIKE1 (DCL1)首先在折叠的BS处切割，释放出较短的前体miRNA (pre-miRNA)。接下来，距离第一次切割21nt的第二次切割释放出miRNA/miRNA*双链体，包括被甲基转移酶HUA ENHANCER 1(HEN1)2’-O-甲基化的两个核苷酸的3’突出端。或者，对于环-碱基加工的前体，DCL1产生释放末端环的第一个切割，然后继续朝向前体的碱基释放miRNA/miRNA*双链体。很典型的，双链体的一条链(引导链)被挑选成ARGONAUTE (AGO)蛋白(大多数植物miRNA的AGO1),产生RNA诱导的沉默复合物(RISC),该复合物主要通过其核酸内切裂解，较少通过其翻译阻遏,来识别和沉默互补靶RNA。

人工miRNA(amiRNA)是21nt的miRNA，通过计算设计，用于重定向内源性miRNA生物发生和沉默机制，以高效和特异性选择性抑制特定靶RNA(没有预测的脱靶)。在植物中通过表达修饰的MIR基因产生amiRNA，产生pri-miRNA前体，其中天然miRNA/miRNA*双链体的序列被amiRNA/amiRNA*双链体的序列取代。选择合适的pri-miRNA骨架对于确保有效和准确的前体加工以及产生有效靶沉默所需的大量amiRNA是至关重要的。与用于产生amiRNAs的其他植物pri-miRNA相比，来自拟南芥MIR390a(pri-AtMIR390a)的521nt长的pri-miRNA前体是高效和精确加工的pri-miRNA。此外，pri-AtMIR390a已被用于在多种植物物种(包括模式植物和作物)中表达amiRNA，以有效沉默内源基因和病毒RNA。有趣的是，pri-AtMIR390a具有仅31 nt的相对较短的DSL区域，允许仅用跨越该结构的两个寡核苷酸合成完整的折叠。这一特征有助于开发一种具有成本效益的高通量方法，将amiRNA插入片段直接引入一系列“B/c”载体，包括pri-AtMIR390a序列。

AmiRNAs被用作功能基因组学和作物改良的生物技术工具。然而，目前amiRNA技术的限制是使用相对长的前体，主要基于全长pri-miRNA序列，以在体内产生amiRNA。减小amiRNA前体的大小应该具有几个生物技术优势，例如更具成本效益地生产amiRNA构建体，或者更有效地在体外或细菌中合成amiRNA前体以局部应用于植物。另一个限制是需要用amiRNA转基因对植物基因组进行遗传修饰。使用植物DNA病毒在本氏烟草中成功表达真实的amiRNAs是有可能的，尽管感染通常是由含有表达amiRNA的病毒载体的质粒在植物组织中的农杆菌渗入法引发的，并且仅限于少数宿主物种。因此，这种所谓的基于amiRNA的病毒诱导基因沉默(amiR-VIGS)技术需要进一步优化，以便在多种植物物种中更广泛地应用，并避免产生转基因植物组织。

近日，来自西班牙的科学家在著名国际期刊《Nucleic Acids Research》上发表了名为“Transgene-free, virus-based gene silencing in plants by artificial microRNAs derived from minimal precursors”的研究文章。作者分析了从广泛使用的521 nt长的拟南芥AtMIR390a pri-miRNA中产生有效的amiRNA的最小结构和序列要求。在拟南芥中作者筛选了大量瞬时表达内源基因和人工缩短的基于MIR390的前体的amiRNA，并得出结论，仅89 nt的嵌合前体就可以产生高效且准确加工的amiRNAs。这种最小前体在表达针对内源基因的amiRNA的拟南芥转基因植物中得到进一步验证。值得注意的是，当从RNA病毒中表达时，最小但不是全长的前体产生真正的amiRNA，并诱导本氏烟草中广泛的基因沉默，这种病毒可以通过喷洒感染性粗提取物施用于叶子。研究结果表明，可以缩短amiRNA前体的长度而不影响沉默效果，并且包含最小amiRNA前体的病毒载体可以以无转基因的方式诱导全植物基因沉默。

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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