导读
黄连（CCF）作为一种广泛使用的中药，对阿尔茨海默症（AD）有治疗作用，但其作用机制尚未阐明。本研究旨在通过肠脑轴揭示CCF的作用机制，为AD的临床治疗提供新的策略。我们使用APPswe/PS1ΔE9小鼠作为AD模型，并通过灌胃给予CCF提取物；采用巴恩斯迷宫法检测CCF对AD的治疗效果。为了揭示CCF在AD治疗中的作用机制，我们选择Vanquish Flex UHPLC orbitrap fusion lumos mass检测内源性差异代谢产物；MetaboAnalyst 5.0用于推导相关的代谢途径；同样，为了探索CCF对肠脑轴的影响，我们利用Vanquish Flex UPLC-Orbitrap fusion lumos mass来检测CCF给药后AD小鼠短链脂肪酸（SCFAs）含量的变化；通过UPLC/ESI/qTOF-MS对CCF中的原型成分和代谢产物进行了鉴定，并探讨了它们对短双歧杆菌的影响。CCF缩短了AD小鼠的潜伏期，提高了AD小鼠靶象限比例，使AD小鼠的迷宫路线图更简单；CCF调节AD小鼠的15种潜在代谢产物，还包括SCFA中的ILA（吲哚-3-乳酸）；CCF作用于AD小鼠的组氨酸和苯丙氨酸代谢途径；CCF使AD小鼠的乙酸和ILA含量增加；在AD小鼠的粪便样本中检测到CCF中的木兰花碱、药根碱、黄连碱、格兰地新、芬式唐松草定碱、巴马亭、黄连素、表小檗碱，羟基化药根碱和3-methoxydemethyleneberberine；木兰花碱、巴马亭红碱、13-甲基黄连素、黄连素、黄连碱和巴马亭促进短双歧杆菌的生长。我们已经证明了CCF通过调节SCFAs作用于肠-脑轴来治疗AD。
研究亮点：
1. 黄连(CCF)可改善AD小鼠的认知功能障碍；
2. 这是首次发现CCF作用于组氨酸和苯丙氨酸代谢途径来治疗AD；
3. CCF能提高AD小鼠血清和粪便中SCFAs中乙酸和吲哚-3-乳酸的含量；
4. CCF中的木兰花碱、13-甲基小檗碱、巴马亭红碱作用于短双歧杆菌，对AD有一定的治疗作用；
5. 本研究为临床治疗AD的药物开发奠定了基础。
论文ID
原名：Study on the mechanism of Coptis chinensis Franch. And its main active components in treating Alzheimer's disease based on SCFAs using Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS
译名：基于SCFAs的Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS研究黄连及其主要活性成分治疗阿尔茨海默病的机制
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.4
发表时间：2023.04
通讯作者：王琦&舒尊鹏
通讯作者单位：哈尔滨医科大学&广东药科大学
实验设计
实验结果
1. CCF提取物对AD小鼠认知功能障碍有改善作用
为了阐明CCF提取物对AD的治疗作用，我们采用巴恩斯迷宫试验检测CCF对AD小鼠认知功能的影响。我们发现模型组小鼠的潜伏期明显长于对照组小鼠（P < 0.01），低剂量CCF提取物缩短了AD小鼠的潜伏期（P < 0.01），而高剂量CCF提取物对此没有抑制作用（图2A）。此外，与对照组相比，模型组小鼠的靶象限比例明显降低（P<0.01），低剂量CCF提取物改善了这一现象（P<0.05），而高剂量CCF提取物没有显著差异（图2B）。直观地说，模型组小鼠的迷宫路线图比对照组更复杂，低剂量CCF提取物和高剂量CCF提取液使AD小鼠的迷宫路线图更简单（图2C）。结果表明，低剂量CCF提取物改善了AD小鼠的认知功能障碍，提高了其学习记忆能力。
图1 CCF改善了阿尔茨海默症（AD）小鼠的认知功能障碍
（A）高效液相色谱法测定CCF总生物碱的色谱图。（B）分离出的化合物的结构式。（1，木兰花碱；2，格兰地新；3，黄连碱；4，表黄连碱；5，非洲防己碱；6，药根碱；7，小檗红碱；8，黄连素；9，巴马亭；10，13-甲基巴马亭）。
2. 筛选潜在的生物标志物
为了探讨CCF提取物在AD小鼠中的代谢作用，我们对AD小鼠的粪便进行了Vanquish LC Orbitrap Fusion Lumos Tririd/MS分析。从峰形的角度来看，我们发现三组之间存在差异，但高剂量CCF组的峰形与对照组更相似。不同样品组间保留时间的再现性较好，未发现异常总离子色谱图（TIC）（图3），表明样品处理的重复性和仪器精度良好。
为了阐明CCF提取物对AD小鼠代谢产物的调节作用，我们使用PCA和OPLS-DA分析样本之间的代谢差异，并对数据的相似性进行分类。我们通过主成分分析确定，模型组的样本分布与对照组不同，表明AD小鼠发生了代谢变化。给予CCF提取物后，高剂量CCF组的样本分布不仅与模型组有本质上的不同，而且往往更接近对照组（图S1）。通过OPLS-DA，我们观察到三组之间样本分布的显著差异。此外，与模型组相比，对照组和高剂量CCF组沿轴显著分离（正交信号校正过程中正交分量的得分值表明组内样本之间的差异）（图S2），提示AD小鼠的正常生理代谢过程受到干扰，CCF提取物可显著改变AD小鼠的异常代谢。此外，为了验证OPLS-DA的有效性，我们在三组之间进行了配对排列测试。我们发现R2在纵轴上的截距低于原始值，Q2在纵轴上截距为负值，表明本实验建立的OPLSDA模型具有良好的差异稳定性，预测可靠性高，没有拟合现象（图S3）。结果表明，高剂量CCF提取物可调节AD小鼠的代谢产物。
为了确定中药提取物在AD治疗中的具体作用的代谢物，我们通过热图直接显示给药前后AD小鼠内源性代谢物含量的差异（图4）。此外，S图用于筛选CCF调节AD小鼠的潜在生物标志物。S图表示模型中重要的相关变量，图中的每个点表示一个变量，变量离原点越远，导致组之间差异的贡献就越显著，即VIP值越大（图5A–D）。我们在正离子流中从粪便样品中鉴定出6种不同的代谢物：鸟嘌呤、腺嘌呤、甲基异烟酸、2′-脱氧腺苷、硬脂酰胺和水解伏马菌素B1（表1（1），图5E），在负离子流中检测到9种不同的代谢产物：二十碳五烯酸（EPA）、N-乙酰神经氨酸（NANA）、L-（−）-苹果酸（L-MA）、亚油酸-生物素、4-indolecarboxaldehyde、β-D-葡萄糖醛酸、尿酸（UA）、琥珀酸（SA）和ILA（表1（1），图5F）。我们发现，在粪便样本中，与模型组相比，高剂量CCF提取物中鸟嘌呤、腺嘌呤、甲基异烟酸、2′-脱氧腺苷、硬脂酰胺、水解伏马菌素B1、EPA、NANA、亚油酸-生物素和4-indolecarboxaldehyde的水平降低，显示出显著差异（P<0.05），此外，给药组的L-MA、β-D-葡萄糖醛酸、UA、SA和ILA水平也发生了逆转（图5G和H）。结果证明，高剂量CCF提取物通过调节上述潜在的生物标志物显著改善AD小鼠的异常代谢。值得注意的是，在筛选出的15种潜在生物标志物中，我们在SCFAs中发现了ILA，这一发现使我们初步假设CCF通过调节肠道菌群来治疗AD。
表1 潜在的生物标志物数据（1）和代谢途径（2）
图2 CCF改善AD小鼠的认知功能障碍
（A）AD小鼠巴恩斯迷宫实验潜伏期统计图，n=6。（B）小鼠巴恩斯迷宫实验的靶象限统计图，n=6。（C）小鼠巴恩斯迷宫测试路线图，n=6。与对照组比较**P<0.01，与模型组比较##P<0.01。与模型组相比#P<0.05。
3. 代谢途径分析
为了揭示CCF提取物对AD治疗中代谢途径的调节作用，MetaboAnalyst 5.0用于分析每个样本中不同代谢物的途径。我们发现CCF具有调节组氨酸、核黄素、烟酸-烟酰胺、苯丙氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸生物合成、D-谷氨酰胺-D-谷氨酸、精氨酸生物合成、花生四烯酸、酪氨酸和丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢途径的作用（表1（2），图S4）。在上述十种代谢途径中，组氨酸和苯丙氨酸代谢途径与肠脑轴有关。因此，本研究推测CCF在AD治疗中作用于组氨酸和苯丙氨酸代谢途径，调节肠脑轴，为AD临床治疗新机制的研究奠定基础。
表2 小鼠粪便中黄连（CCF）提取物的代谢物
++，在高丰度下检测到；+，检测。
图3 CCF提取物调节AD小鼠的代谢产物组成
小鼠粪便样品的总离子色谱图（TIC），（A）对照，正离子流。（B）对照，负离子流。（C）模型，正离子流。（D）模型，负离子流。（E）模型加高剂量CCF处理组（+CCF-H），正离子流。（F）+CCF-H，负离子流。
4. SCFAs含量检测
Vanquish LC Orbitrap Fusion Lumos Tririd/MS用于表达AD小鼠粪便、大脑和血清中SCFAs的含量。我们发现，高剂量CCF提取物中的乙酸含量比对照组增加了56.19%，是模型组的5倍，粪便样本中高剂量CCF提取物中的ILA含量比对照组增加了8倍，比模型组增加了105倍；在血清样品中，高剂量CCF提取物中的乙酸含量比对照组增加了2倍，比模型组增加了72.64%；高剂量CCF提取物中ILA的含量比对照组增加了8倍，比模型组减少了20.57%。同时，我们发现高剂量CCF提取物中的乙酸含量比对照组增加了23.81%，比模型组增加了7.64%，高剂量CCF提取物中ILA的含量比对照组增加了51.99%，脑样本中ILA含量比模型组增加了3倍。我们没有在所有样品中检测到丙酸或丁酸（表S1，图6），因此，我们进一步推测CCF可以通过肠脑轴影响SCFAs中乙酸和ILA的含量来治疗AD。
图4 CCF调节AD小鼠内源性代谢产物
(A)代谢物在正离子流中的热图。(B)代谢物在负离子流中的热图。
5. 代谢物鉴定
为了鉴定小鼠粪便中CCF的原型成分或代谢产物，我们使用UPLC/ESI/qTOF-MS检测小鼠粪便样本。在与对照物质（表2）比较后，我们在粪便样本中发现了CCF的八种原型成分和两种属于CCF的代谢物：m/z 342.1704，木兰花碱（图7A）；m/z 338.1389，3- methoxydemethyleneberberine和药根碱（图7B）；m/z 320.0920，黄连碱（图7C）；m/z 322.1077，格兰地新和芬氏唐松草定碱（图7D）；m/z 352.1549，巴马亭（图7E）；m/z 3361236，黄连素和表黄连碱（图7F）；m/z 355.2629，羟基化药根碱，我们在m/z 355-2629中发现了次级片段m/z 337.2523，通过比较鉴定为药根碱（图7G）。
图5 CCF提取物诱导AD小鼠体内差异代谢产物的水平
（A）正离子流中对照与模型的S图。（B）负离子流中对照与模型的S图。（C）正离子流中模型与+CCF-H的S图。（D）负离子流中模型与+CCF-H的S图。（E）正离子流中潜在生物标志物的箱形图。（F）负离子流中潜在生物标志物的箱形图。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。（G）正离子流中代谢物的火山图。（H）负离子流中代谢物的火山图。
图6 CCF调节AD小鼠的短链脂肪酸（SCFAs）
（A）标准品的LC峰。（B）粪便样本的LC峰。（C）血清样本的LC峰，n=5。
6. CCF提取物及其原型成分和代谢产物的研究
为了阐明治疗AD的药效物质基础，我们筛选了促进短双歧杆菌生长的原型成分或代谢产物。我们发现，10μg/mL和100μg/mL的木兰花碱、巴马亭红碱、13-甲基黄连素和黄连素，10μg/mL黄连碱和100μg/mL巴马亭促进短双歧杆菌的生长，1μg/mL的木兰花碱、巴马亭红碱和13-甲基黄连素也具有促进作用，而1μg/mL的其他成分对短双歧杆菌的生长具有抑制作用，但是我们发现短双歧杆菌的含量随着CCF提取物浓度的降低而降低，尤其是当CCF提取物的浓度大于1 mg/mL时（P<0.01）（图8），这证明CCF提取物对AD治疗的肠脑轴有作用。
图7 小鼠粪便中CCF的代谢产物
（A）木兰花碱。（B）3-甲氧基去甲基黄连素，药根碱。（C）黄连碱。（D）格兰地新，芬氏唐松草定碱。（E）巴马亭。（F）黄连素，表黄连碱。（G）羟基药根碱。
图8 CCF提取物及其活性成分促进短双歧杆菌的生长
短双歧杆菌单个菌株生长的OD值，n=3。与对照组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
讨论
本研究创新性地从脑肠轴角度揭示了CCF通过调节SCFAs治疗AD的机制。
在药效学研究中，为了消除雌激素对认知功能的影响，我们将雄性APPswe/PS1ΔE9小鼠用作AD模型，并用CCF提取物处理。我们观察到低剂量CCF提取物改善了AD小鼠的认知功能障碍，而高剂量CCF提取物的治疗效果不如低剂量CCF提取液显著。根据Chang等人先前的研究，高剂量黄连素对血脂的调节作用不如低剂量黄连素，因为高剂量的黄连素由于降低胆固醇的反馈而抑制了其对胰岛素诱导基因2（Insig-2）的促进作用，因此我们假设这是由于高剂量CCF的反馈抑制或高剂量CCF之间的靶点竞争。在本研究中，由于CCF中生物碱成分的生物利用度较低，我们选择高剂量CCF提取物组进行代谢组学研究。使用高剂量CCF提取物处理可使活性成分更大程度地进入血液，并更清楚地显示CCF调节的差异代谢产物。
粪便样本是通过Vanquish Flex UHPLC orbitrap fusion lumos mass进行检测的，该质谱可以精细区分同位素，以便更好地分析小分子结构。我们发现，CCF提取物增加了AD模型小鼠的潜在生物标志物水平，包括鸟嘌呤、腺嘌呤、甲基异烟酸、2′-脱氧腺苷、硬脂酰胺、水解伏马菌素B1、亚油酸-生物素、4-indolecarboxaldehyde、β-D-葡糖醛酸、EPA、NANA、L-MA、UA、SA和ILA，并倾向于向对照组靠拢。值得注意的是，我们在筛选的15种潜在生物标志物中发现了SCFAs中的ILA，这一发现与之前的其他研究一致，即ILA与DNA损伤和脂质过氧化呈负相关，保护神经，并通过作用于Ras/细胞外调节蛋白激酶（ERK）途径刺激神经元分化。此外，EPA、NANA和苹果酸通过降低炎症因子如白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、TNF-α的水平发挥抗炎作用，从而保护神经免受炎症损伤。此外，研究发现，大脑中高水平的UA可减少Tau蛋白的过度磷酸化，并通过作用于toll样受体4（TLR4）/核因子-κB（NF-κB）途径缓解小鼠海马的炎症反应，从而实现神经保护作用。SA通过改善线粒体氧化磷酸化功能障碍发挥抗氧化作用，从而保护神经细胞。在获得的代谢产物中，鸟嘌呤、腺嘌呤、异烟酸甲酯、2′-脱氧腺苷、亚油酸-生物素、4- indolecarboxaldehyde、β-D-吡喃葡萄糖醛酸、硬脂酰胺和水解伏马菌素B1未被发现与AD有关，这可能是AD的潜在标志物，值得系统探索。
在我们发现的十种代谢途径中，组氨酸代谢途径中的肌肽通过减少ROS诱导的损伤和随后由糖基化终产物引起的损伤来保护神经。此外，组胺激酶在肠杆菌科基因组中编码，并介导病原体分泌系统的激活，这表明组氨酸代谢与肠脑轴之间存在关系。此外，先前的研究表明，AD患者的苯丙氨酸代谢途径中苯丙氨酸和L-氨基酸氧化酶水平升高，这表明苯丙氨酸可能是AD的潜在病理标志物。一项研究表明，肠道微生物介导的苯丙氨酸代谢途径与自闭症有关。因此，本研究推测CCF在AD治疗中作用于组氨酸和苯丙氨酸代谢途径，调节肠脑轴，为AD临床治疗新机制的研究奠定了基础。
此外，我们发现AD小鼠给药后血清和粪便中乙酸和ILA的含量显著增加。研究表明，乙酸在体外可以抑制Aβ的聚集。ILA是双歧杆菌产生的唯一色氨酸代谢产物，它通过促进ERK1/2和AMP反应元件（CRE）结合蛋白（CREB）蛋白磷酸化作用于Ras/细胞外信号调节激酶（Ras/ERK）途径，促进神经生长因子（NGF）诱导的PC12细胞轴突生长。临床研究表明，丙酸刺激调节性T细胞（Tregs）可降低多发性硬化症患者的复发率。丁酸减少了缺血性中风大鼠小脑的梗死体积，但我们没有在AD小鼠的粪便和血清中检测到丙酸和丁酸。因此，我们推测CCF可以通过肠脑轴影响SCFAs中乙酸和ILA的含量来治疗AD，但乙酸和ILA在体内的具体药理机制尚未阐明，未来我们将重点研究乙酸和ILA在体内治疗AD的机制。
然后，我们在AD小鼠的粪便样本中检测CCF中的木兰花碱、药根碱、黄连碱、格兰地新、芬氏唐松草定碱、巴马亭、黄连素、表黄连碱，羟基化药根碱和3- methoxydemethyleneberberine。研究表明，中药的一些有效成分生物利用度差，血药浓度低。例如在对单一药材的血浆药代动力学和经典复方葛根芩连汤的化合物代谢产物的研究中，研究发现，原黄连素生物碱在大鼠血浆中的首过效应大于50%，口服生物利用度小于1%，尿液消除率小于0.02%。此外，黄连素的生物利用度非常低，肠道吸收率仅为5-10%。多糖和皂苷还具有口服吸收差和生物利用度低的特点。因此，我们选择粪便对CCF的代谢产物进行分析，可以更好地检测活性成分。研究者们已经发现，木兰花碱通过增加谷胱甘肽含量在缺血性中风中发挥抗氧化作用，并通过上调Sirt1和AMPK的表达水平，作用于Sirt1/AMPK通路，抑制缺血性神经元损伤。研究表明，巴马亭通过抑制ERK1/2的磷酸化和下调TNF-α和IL-1β的表达，减轻大鼠糖尿病神经性疼痛。黄连碱通过抑制吲哚胺2，3-双加氧酶来抑制AD小鼠小胶质细胞的活化和淀粉样斑块的形成。结果表明，小鼠认知功能障碍的改善与CCF有关，但在CCF中检测到的其他原型成分和代谢产物与脑病无关。
最后，我们观察到了木兰花碱、巴马亭红碱、13-甲基黄连素、黄连素、黄连碱和巴马亭促进短双歧杆菌生长的现象，这进一步证明了CCF提取物对AD治疗的肠脑轴有作用。除了上面提到的关于黄连素、木兰花碱、巴马亭和黄连碱与脑病之间的相关性报道外，尽管巴马亭红碱和13-甲基黄连素可以促进短双歧杆菌的生长，但尚未发现与脑病之间相关性的研究。我们发现CCF的所有成分都不能促进短双歧杆菌的生长，因此我们推断CCF本身具有抗菌活性。研究表明，格兰地新、黄连碱、芬氏唐松草定碱、药根碱、非洲防己碱、表黄连碱能抵抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。尽管尚未对短双歧杆菌进行研究，但从获得的数据来看，这些化合物对短双歧菌的生长具有抑制作用。尽管我们检测到的这些活性代谢产物并没有促进短双歧杆菌的生长，它们可能通过其他渠道发挥作用，例如，13-甲基黄连素可以通过增强自噬、抑制炎症因子的循环和减少AD患者的中枢炎症来限制肠道NLRP3炎症小体的激活，因此其他化合物的这种分子机制需要在未来进一步研究。
结论
在本研究中，我们揭示了CCF作用于肠脑轴治疗AD的机制。巴恩斯迷宫证实CCF改善了AD小鼠的认知功能障碍。此外，代谢组学阐明，CCF调节鸟嘌呤、腺嘌呤、甲基异烟酸、2′-脱氧腺苷、硬脂酰胺、水解伏马菌素B1、EPA、NANA、L-MA、亚油酸-生物素、4-indolecarboxaldehyde、β-D-葡萄糖醛酸、UA、SA和ILA，影响组氨酸和苯丙氨酸代谢途径。此外，在含量测定中，我们检测到CCF增加了AD小鼠的乙酸和ILA含量。此外，通过对代谢产物的鉴定，我们发现木兰花碱、巴马亭红碱、13-甲基黄连素、黄连素、黄连碱和巴马亭促进短双歧杆菌的生长，为AD的治疗奠定了药效物质基础。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S037887412300260X
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