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近日，杜娟娟课题组在《德国应用化学》（Angewandte Chemie International Edition）杂志发表题为“工程化组氨酸富集肽增强抗体靶向细胞内部递送功能蛋白的内体逃逸能力（Engineered Histidine-Rich Peptides Enhance Endosomal Escape for Antibody-Targeted Intracellular Delivery of Functional Proteins）”的研究论文。该工作被评为hot paper，并选用为封面文章。该工作报道了一种基于工程化组氨酸富集肽的模块化递送系统，提高了蛋白质药物的胞质递送效率，实现了组织特异性的蛋白质胞内递送。该工作报道的递送策略在未来基因编辑、肿瘤治疗和细胞命运调控等临床应用和科学研究中具有广泛的应用前景。
研究背景
许多疾病的发生与细胞内代谢异常紧密相关。通过药物靶向调控相关的关键分子或功能通路，对其进行干预已成为疾病治疗的重要方法之一。近年来，涌现出许多新的疾病靶点，其中有些重要的疾病相关靶点尚缺乏明确定义的小分子结合位点。相反地，生物大分子（如多肽、蛋白质、核酸及其复合物等）药物在靶点选择方面几乎没有限制，这为药物研发带来了广阔的前景。
自从受体介导的内吞作用被发现以来，人们为寻找高效利用这一生物过程作为治疗策略关键组成部分的方法付出了重要的努力。抗体偶联药物（Antibody-drug-conjugates，ADCs）已充分展示了受体介导的内吞作用在特异性递送治疗载荷分子进入靶细胞方面的潜力。目前，已有16种抗体药物偶联物获得监管机构的批准，并成功上市。在ADC技术中，抗体作为载体，通过与细胞表面的受体结合并引发内吞作用，能够将携带细胞毒性小分子药物的载荷，以高度特异性的方式运送至靶向细胞，从而有效地应用于肿瘤治疗领域。然而，除了小分子药物以外，诸如蛋白质和多肽等大型生物分子，作为参与细胞内外生物过程调控的重要因子，具备巨大的潜力和价值。
然而，要实现将大分子如蛋白质和多肽等纳入ADC系统的挑战不容忽视。尽管想法很诱人，简单地将ADC系统中原本的小分子药物替换成大分子，往往会面临一些困难。这是因为许多通过内吞途径进入细胞的蛋白质和多肽，往往会被溶酶体降解或者排出细胞外，而无法进入细胞质内，从而无法发挥其预期的功能。
有研究报道，多肽诱导的内体逃逸（Endosomal escape）增强有助于将各种蛋白质载荷递送到细胞质中。其中，HA2和GALA是人们研究最多的内体逃逸肽（Endosomal escape peptides, EEPs），它们具有pH依赖性的膜扰动活性。在酸性的内溶酶体环境中，它们引发膜扰动，使载荷分子释放到细胞质中。通过应用pH响应性膜扰动的原理，已经发现了多种能够促进内体逃逸的多肽。然而，迄今为止，由于低效率、细胞毒性和潜在的免疫原性等问题，其在治疗应用方面尚存挑战。
研究过程与结论
细胞穿透肽（Cell-penetrating peptides, CPPs）是一类衍生自天然蛋白质或从头设计的多肽（一般认为其长度为5~30 aa），其具有携带生物大分子穿透细胞膜进入细胞的能力。阳离子型CPPs通常富含精氨酸残基和赖氨酸残基，这种正电性在系统性给药中可能会引起难以预测的毒副作用。组氨酸的pKa大致为6.5，其在生理条件下近乎呈电中性，在酸性环境中则由于质子化而呈现出正电性。受"组氨酸开关（Histidine switch）"概念的启发，作者猜想可以利用内体的酸性条件促进pH多肽的电性或构象转变，实现低pH依赖的膜扰动功能，从而克服内体逃逸这一瓶颈问题。
首先，作者团队通过文献调研，选取了7条人们广泛研究的阳离子型CPPs。将阳离子CPPs中的赖氨酸残基和精氨酸残基突变为组氨酸残基，获得了具有pH响应性的多肽。与CPP不同，组氨酸残基替换使这些多肽在生理条件下呈现近电中性，减少了其与细胞膜、膜表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、细胞外基质等负电荷分子的非特异性作用；但在细胞内吞后，多肽进入酸性的内体后，其组氨酸残基被质子化，显示出强正电荷，并与内体膜相互作用，促进货物蛋白进入细胞质中发挥作用。
图1 模块化递送系统的工作示意图
根据这一设计思路，团队改造了多个CPP，并发现了多个具有pH响应型莫活性的多肽，其中hsLMWP展示出有效的内体逃逸效率。基于这一发现，团队进一步构建了抗体靶向的模块化递送系统。值得一提的是，为了研究hsLMWP的内体逃逸效率，作者团队建立了基于纳米荧光素酶（Nanoluciferase）的相对定量系统。定量结果显示hsLMWP介导的内体逃逸效率达到接近2%，优于HA2和GALA所介导的内体逃逸效率。
利用所提出的模块化递送系统，研究团队在实验中取得了显著的成果。首先，他们成功地运用该系统将重组酶Cre和促凋亡蛋白BID递送至靶向细胞内。这一创新性方法使得基因重组和细胞凋亡诱导能够以细胞特异性的方式进行，从而有效地调控细胞的功能。
为了进一步验证该系统的疗效，研究团队采用了小鼠皮下移植瘤模型。实验结果表明，TR-hsLMWP-BID模块化蛋白在动物体内展现出了卓越的抗肿瘤性能。这意味着通过该系统递送的蛋白质能够在体内精确地识别肿瘤细胞，并引发针对这些肿瘤细胞的特异性反应，从而达到治疗的目的。更为重要的是，这一疗效并没有对除肿瘤组织以外的其他主要器官造成明显的毒副作用，这为进一步的临床应用奠定了坚实的基础。
综合而言，该模块化递送系统的引入为基因治疗和细胞治疗领域带来了新的可能性。其通过特定的递送机制，实现了基因重组和细胞凋亡的高效诱导，且在动物实验中展现出了显著的治疗潜力。这项研究为肿瘤治疗提供了新的方向，也为开发更安全有效的治疗方法提供了有力支持。然而，进一步的临床研究和验证仍然是必要的，以确保其在人体中的应用安全性和疗效。
图2 模块化递送系统的开发和应用
研究意义
该论文所报道的策略着力解决大分子药物进入细胞的瓶颈问题，即内体陷阱问题，对于拓宽大分子药物的应用具有重要的意义。同时，采用模块化设计的策略，论文中设计了抗体靶向的组织特异性递送系统，有望灵活应用于多种不同的抗体/货物组合。未来，这种策略有望扩展到基因编辑和核酸递送等多个领域中去。
科学家小档案
杜娟娟 清华大学药学院
杜娟娟博士于2007年在北京大学获得化学学士学位，并加入了加州大学洛杉矶分校（UCLA）卢云峰教授的实验室从事纳米医药的研究。2012年获得博士学位之后，她加入了斯克里普斯研究所（TSRI）和加州生物医学研究所（CALIBR）Peter G. Schultz教授的实验室。博士后期间的工作主要集中在建立新型的多特异性抗体构建方法，从而获得治疗癌症、老年痴呆症等的新疗法。2016年，杜娟娟博士加入清华大学药学院展开独立研究。目前，杜娟娟博士的研究工作已于本领域的权威期刊Nat. Nanotech., Nat. Chem. Biol., J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., Adv. Funct. Mater., ACS Nano, Proc. Natl. Acad. Sci.等上发表SCI论文多篇。
转自：“创新清华”微信公众号
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