ACS Chem. Biol. | G蛋白偏好的胞内血管紧张素受体激动剂促进肌成纤维细胞分泌胶原蛋白

英文原题：G Protein-Biased Agonists for Intracellular Angiotensin Receptors Promote Collagen Secretion in Myofibroblasts

供稿人：曹宇辉 北京大学

大家好，今天为大家介绍一篇 ACS Chemical Biology 文章，标题为“G Protein-Biased Agonists for Intracellular Angiotensin Receptors Promote Collagen Secretion in Myofibroblasts”，文章的通讯作者是来自麦吉尔大学的 Terence E. Hébert教授。在本文中，作者通过开发了一种合成含非天然氨基酸多肽的新方法，并藉此合成了一系列可被紫外光原位激活的血管紧张素II类多肽前体，将其应用于肌成纤维细胞分泌胶原蛋白机制的研究中。

血管紧张素II是一类寡肽类激素，其1型受体（AT1R）在维持心脏稳态和调节血压方面起着核心作用。当心肌损伤时，血管紧张素II可以维持细胞生存，并增加胶原蛋白的分泌，以促进伤口的愈合；但持续的血管紧张素II刺激也可能导致心肌细胞肥大，并引发间质纤维化等疾病。目前，血管紧张素受体阻滞剂和血管紧张素转换酶抑制剂等药物可在一定程度上控制病情，但是对患者生活质量和总生存率的改善并不明显。因此，寻找靶向AT1R治疗的新策略十分重要。

当不同的配体与同一受体发生相互作用时，有可能会触发不同的下游信号通路，这一现象称为配体的偏好性。近年来，一些研究指出AT1R具有若干种配体偏好性下游事件，如G蛋白活化和β-抑制蛋白（β-arr）招募等。有趣的是，AT1R不仅在细胞膜上表达，在心肌细胞和心脏成纤维细胞中也存在定位于核膜的功能活跃的AT1R，因此AT1R也可能存在受亚细胞定位影响的配体偏好。尽管人们期望研究定位于核膜的AT1R功能与配体偏好性，但在接触核膜定位的AT1R之前必须先穿过细胞膜，因此将受到细胞膜定位AT1R的影响，为研究增加较大困难。为了消除细胞膜定位AT1R对研究的干扰，作者团队计划在体外合成带有3,4-二甲氧基-6-硝基苄基（DMNB）保护的AT1R偏好性多肽配体。该多肽具备重要功能的酪氨酸残基被DMNB保护，因此失去了激活AT1R的能力；而在紫外光的照射下，DMNB保护基可在2分钟以内被完全切除，从而恢复其活性。因此，作者团队先使用DMNB保护的AT1R偏好性多肽配体处理细胞，待其进入细胞质基质后，再洗去膜外游离的多肽，并使用紫外光照射，即可选择性地研究定位于核膜的AT1R功能与配体偏好性。

图1 可与固相多肽合成兼容的DMNB修饰反应

使用传统方法合成含有DMNB保护的AT1R偏好性多肽配体时，通常需要提前合成并纯化DMNB保护的酪氨酸，随后进行固相多肽合成，如图1下方路线所示。该方法不仅需要预先引入、脱除酪氨酸的保护基团，从而增加反应步数，又存在着合成效率低、产物分离纯化难等问题。为了简化实验流程，作者团队开发了一种可与固相多肽合成兼容的DMNB修饰反应，只需要在多肽合成进行到N端为酪氨酸一步时，使用2当量3,4-二甲氧基-6-硝基苄溴处理，便可在固载的多肽酪氨酸残基侧链引入DMNB保护基，从而缩短了反应步骤，如图1上方路线所示。以血管紧张素II的合成为例，尽管这一过程会将总产率由7.1%降低至6.0%，但节约了反应步数，减少了时间与人力成本。

在开发了新的合成路线后，作者团队合成了一系列DMNB保护的AT1R偏好性多肽配体，其中包括3条β-arr 偏好的多肽配体（SI，TRV026，TRV027）和2条G蛋白偏好的多肽配体（TRV055，TRV056），其总产率均在7.2% ~ 8.0%之间。随后，作者团队测试了这些多肽的水溶液稳定性与光稳定性，发现这些多肽在-20oC下可长期存放，即使在37℃的水溶液中存放24小时，也可保持80%~90%的纯度；但一旦使用紫外光进行照射，便可在2分钟内完全脱除DMNB基团。同时，作者团队也使用BRET技术测试了脱除保护基后AT1R偏好性多肽配体的活性，如图2所示。作者团队发现，血管紧张素II多肽在DMNB保护下活性很弱，但脱除保护基后几乎可以完全恢复其活性；相对地，具有偏好性的多肽配体在脱除保护基前不会引发任何一种下游信号传递过程，脱除保护基后也仅能引发其偏好的下游信号传递过程，而对其非偏好的下游信号传递过程则几无调控功能。

图2 测试各AT1R偏好性多肽配体脱笼前后的活性

最后，作者团队以胶原蛋白的分泌作为AT1R激活的读出信号，比对了各AT1R配体在DMNB保护基切除前后的激活能力。由于这些被DMNB保护的多肽亲水性降低，因此它们更易穿透细胞膜进入细胞质基质中；而当DMNB保护基被切除后，多肽的透膜能力将下降，因此其不再能逃逸到细胞膜外。基于这一原理，使用紫外光原位产生的激动剂分子仅作用于核膜定位的AT1R。作者团队分离了大鼠的肌成纤维细胞，并使用未携带DMNB保护基的各多肽配体处理，发现它们具有相似的促胶原蛋白分泌能力，如图3A所示。随后，作者团队使用各DMNB保护的AT1R多肽配体处理细胞，再使用紫外光脱除保护基，发现血管紧张素II与G蛋白偏好的多肽配体在脱除保护基后仍可有效地促进胶原蛋白分泌，而β-arr 偏好的多肽配体则无此效果，如图3B所示。这一结果暗示，促进胶原蛋白分泌的AT1R很有可能具有核膜定位，且其激活配体具有G蛋白偏好性。为了进一步验证此结果，作者团队采用了缬沙坦（valsartan）和氯沙坦（losartan）两种AT1R抑制剂药物分别与DMNB保护的G蛋白偏好性配体共同处理细胞。缬沙坦是一种亲水的药物，它通常作用于细胞膜外侧；而氯沙坦是一种亲脂的药物，较易穿透细胞膜而作用于核膜受体。其实验结果如图3C所示，使用缬沙坦处理的细胞未能观察到胶原蛋白分泌的显著减少，而使用氯沙坦处理的细胞几乎不再分泌胶原蛋白，此结果有力支持了作者的猜想。

图3 大鼠心肌成纤维细胞在各种刺激条件下胶原蛋白的分泌情况

综上，本文的作者团队提出了一种可与多肽固相合成兼容的原位DMNB保护基引入策略，并合成了一系列作用于AT1R的多肽激动剂及其保护型。这些被DMNB保护的多肽激动剂可在紫外光下迅速脱除保护，释放出有活性的激动剂分子。作者利用了其脱除保护基前后亲疏水性的变化，巧妙地使原位产生的活性分子仅作用于核膜定位的AT1R。在此基础上，作者团队证明了肌成纤维细胞中定位于核膜的AT1R主要受G蛋白偏好的血管紧张素激动剂激活，并分泌胶原蛋白。

转自：“ACS美国化学会”微信公众号

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