JEV | 上海交通大学丁显廷/沈广霞等开发新的方法，在4小时内直接检测细胞外囊泡表面蛋白

原发肿瘤表达的细胞外囊泡(EV)表面蛋白是早期癌症诊断的重要生物标志物。然而，这些EV蛋白的检测由于其低丰度和临床样品中非EV成分的干扰而变得复杂。

2023年8月31日，上海交通大学丁显廷、沈广霞及海军军医大学李恒宇共同通讯在Journal of Extracellular Vesicles（IF=16）在线发表题为“Profiling extracellular vesicle surface proteins with 10μL peripheral plasma within 4 h”的研究论文，该研究提出了一种膜特异性分离和两步级联扩增(MESS2CAN)策略，用于在4小时内直接检测EV表面蛋白。

MESS2CAN利用新型脂质探针(一端由PEG2K连接的长链，一端是生物素，另一端是DSPE)和链霉亲和素包被的磁珠。1 h内EV回收率为49.6%。Cas12a系统级联引物交换反应(PER)的双重扩增策略允许以每微升10 EV颗粒的速度对目标蛋白进行敏感检测。利用4个细胞系和90个临床测试样本，该研究证明了MESS2CAN可以分析来自细胞和患者血浆的EVs上HER2、EpCAM和EGFR的表达。MESS2CAN报告了EGFR (AUC = 0.98)和HER2 (AUC = 1)用于区分HER2阳性乳腺癌、三阴性乳腺癌和健康供者所需的特异性和敏感性。

细胞外囊泡(EVs)是纳米和微米大小的膜封闭囊泡的集合，它们由细胞分泌到体液中以实现细胞通信。EVs携带多种遗传自其亲本细胞的生物分子(包括核酸、蛋白质、脂质和代谢物)，并参与广泛的生理和病理过程。值得注意的是，许多肿瘤衍生的EV蛋白已被确定为早期癌症诊断的重要生物标志物，其中EV 蛋白的类型和表达水平可以指示癌症分类和进展状态。然而，临床样本量小，加上非EV成分的干扰，以及靶蛋白的正常低表达水平，给特异性EV分离和蛋白分析带来了巨大挑战，这两者对于准确的临床诊断都是必要的。

在现有的EV分离方法中，超离心被认为是金标准，但它耗时、费力，并且需要大量的初始样样量。其他方法，如过滤、基于聚合物的沉淀和免疫亲和捕获，通常存在EV产率低和/或EV纯度和完整性差的问题。由于这些原因，当只有微量的生物样品可用时，它们不适合临床应用。同样，传统的EV蛋白分析方法，如Western Blot和酶联免疫吸附试验(ELISA)，灵敏度较差，需要对EV进行预分离，限制了其在临床诊断中的应用。生物传感器已被开发用于基于各种平台的EV蛋白敏感检测，如荧光、表面等离子体共振(SPR)、电化学和比色方法。然而，大多数现有生物传感器的灵敏度依赖于复杂的仪器和繁琐的信号放大策略。迄今为止，高效的EV分离和敏感的蛋白检测方法仍然是非常需要的，以便在临床样品中基于EV蛋白进行方便和快速的诊断。

用于EV蛋白分析和乳腺癌检测的MESS2CAN方案说明（图源自Journal of Extracellular Vesicles ）

该研究开发了一种用于EV蛋白检测的膜特异性分离和两步级联扩增(MESS2CAN)策略。该研究首先使用脂质探针(LPs)和链亲和素包被磁珠(SA-MBs)实现了膜特异性分离(MESS)，这允许在SA-MBs表面不加区分地捕获EVs，从而促进EV蛋白的直接下游分析。然后用抗体-寡核苷酸探针标记捕获的EVs。这样就可以通过核酸序列检测来检测蛋白质。对于核酸序列检测，作者级联了两种核酸扩增策略，引物交换反应(PER)和CRISPR / Cas12a系统扩增寡核苷酸，并通过荧光检测器检测目标物种。

该研究使用MESS2CAN实现了靶蛋白检测，检测限为每微升10 EVs。此外，使用MESS2CAN分析了来自四种不同乳腺癌细胞系的EV上HER2、EGFR和EpCAM蛋白的表达，其中MESS2CAN在检测低表达的EV表面蛋白方面表现出优异的性能。该研究进一步将MESS2CAN应用于临床人类样本(30例HER2阳性乳腺癌(HER2+ BC)， 30例三阴性乳腺癌(TNBC)和30例健康供体(HD))中采集的EVs的蛋白质分析，在这三个队列之间实现了高度精确和有效的区分。总之，MESS2CAN是一种高灵敏度体外EV诊断的开创性方法，适用于含有微量EV的临床样品，具有成为早期疾病筛查常规临床检测的巨大潜力。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/jev2.12364

转自：“iNature”微信公众号

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